Локалізований мутагенез та білкова інженерія. Білкова інженерія Отримання та характеристика нового рекомбінантного одно доменного антитіла, що специфічно зв'язується з TNF людини, але не блокує його біологічну активність
Надіслати свою гарну роботу до бази знань просто. Використовуйте форму нижче
Студенти, аспіранти, молоді вчені, які використовують базу знань у своєму навчанні та роботі, будуть вам дуже вдячні.
Розміщено на http://www.allbest.ru/
Курсова робота
з дисципліни: Сільськогосподарська біотехнологія
на тему: «Білкова інженерія»
- Реферат
- Вступ
- I. Білкова інженерія
- 1.1 Поняття білкової інженерії. Історія розвитку
- ІІ. Приклади інженерних білків
- 3.3 Деякі досягнення білкової інженерії.
- Висновок
- Список літератури
Тема роботи: Білкова інженерія.
Ключові слова: біотехнологія, генна інженерія, білок, генетичний код, ген, ДНК, РНК, АТФ, пептиди, епітоп.
Мета курсової роботи: вивчення поняття «білкова інженерія» та потенційних можливостей її використання.
Потенційні можливості білкової інженерії:
1. Змінивши міцність зв'язування речовини, що перетворюється, - субстрату - з ферментом, можна підвищити загальну каталітичну ефективність ферментативної реакції.
2. Підвищивши стабільність білка в широкому діапазоні температур та кислотності середовища, можна використовувати його в умовах, за яких вихідний білок денатурує та втрачає свою активність.
3. Створивши білки, здатні функціонувати у безводних розчинниках, можна здійснювати каталітичні реакції у нефізіологічних умовах.
4. Змінивши каталітичний центр ферменту, можна підвищити його специфічність та зменшити кількість небажаних побічних реакцій
5. Підвищивши стійкість білка до ферментів, що його розщеплюють, можна спростити процедуру його очищення.
6. Змінивши білок таким чином, щоб він міг функціонувати без звичайного для нього амінокислотного компонента (вітаміну, атома металу тощо), можна використовувати його в деяких безперервних технологічних процесах.
7. Змінивши структуру регуляторних ділянок ферменту, можна зменшити ступінь його гальмування продуктом ферментативної реакції за типом негативного зворотного зв'язку і тим самим збільшити вихід продукту.
8. Можна створити гібридний білок, що має функції двох і більше білків.
9. Можна створити гібридний білок, одна з ділянок якого полегшує вихід гібридного білка з клітини, що культивується, або вилучення його з суміші.
Вступ
З давніх-давен біотехнологія застосовувалася переважно в харчовій і легкій промисловості: у виноробстві, хлібопеченні, зброджуванні молочних продуктів, при обробці льону і шкір, заснованих на застосуванні мікроорганізмів. Останні десятиліття можливості біотехнології надзвичайно розширилися. Це пов'язано з тим, що її методи вигідніші за звичайні з тієї простої причини, що в живих організмах біохімічні реакції, що каталізуються ферментами, йдуть за оптимальних умов (температури і тиску), більш продуктивні, екологічно чисті і не вимагають хімічних реактивів, що отруюють середовище.
Об'єктами біотехнології є численні представники груп живих організмів - мікроорганізми (віруси, бактерії, найпростіші, дріжджові гриби), рослини, тварини, і навіть ізольовані їх клітини і субклітинні компоненти (органели) і навіть ферменти. Біотехнологія базується на фізіолого-біохімічних процесах, що протікають в живих системах, в результаті яких здійснюються виділення енергії, синтез і розщеплення продуктів метаболізму, формування хімічних і структурних компонентів клітини.
Головним напрямком біотехнології є виробництво за допомогою мікроорганізмів та культивованих еукаріотичних клітин біологічно активних сполук (ферменти, вітаміни, гормони), лікарських препаратів (антибіотики, вакцини, сироватки, високоспецифічні антитіла та ін.), а також цінних сполук (кормові добавки амінокислоти, кормові білки і т. д.).
Методи генетичної інженерії дозволили здійснити синтез у промислових кількостях таких гормонів, як інсулін та соматотропін (гормон росту), які необхідні для лікування генетичних хвороб людини.
Біотехнологія вирішує не лише конкретні завдання науки та виробництва. Вона має більш глобальна методологічна завдання - вона розширює і прискорює масштаби впливу людини на живу природу і сприяє адаптації живих систем до умов існування людини, тобто до ноосфери. Біотехнологія, таким чином, виступає як потужний чинник антропогенної адаптивної еволюції.
У біотехнології, генетичної та клітинної інженерії перспективні перспективи. З появою нових і нових векторів людина з їх допомогою впроваджуватиме потрібні гени в клітини рослин, тварин і людини. Це дозволить поступово позбутися багатьох спадкових хвороб людини, змусити клітини синтезувати необхідні ліки та біологічно активні сполуки, а потім – безпосередньо білки та незамінні амінокислоти, які вживаються в їжу. Використовуючи методи, вже освоєні природою, біотехнологи сподіваються отримувати за допомогою фотосинтезу водень - екологічно чисте паливо майбутнього, електроенергію, перетворювати на аміак атмосферний азот за звичайних умов.
Фізичні та хімічні властивості природних білків часто не задовольняють умов, у яких ці білки будуть використовуватися людиною. Потрібна зміна його первинної структури, яка забезпечить формування білка з іншою, ніж раніше, просторовою структурою та новими фізико-хімічними властивостями, що дозволяють і в інших умовах виконувати властиві природному білку функції. Конструюванням білків займається білкова інженерія.
Ще однією сферою застосування білкової інженерії є створення білків, здатних нейтралізувати речовини та мікроорганізми, які можуть бути використані для хімічних та біологічних атак. Наприклад, ферменти гідролази здатні знешкоджувати як нервово-паралітичні гази, так і пестициди, що використовуються в сільському господарстві. При цьому виробництво, зберігання та використання ферментів не є небезпечним для навколишнього середовища та здоров'я людей.
Для отримання зміненого білка використовують методи комбінаторної хімії і здійснюють спрямований мутагенез - внесення специфічних змін кодуючі послідовності ДНК, що призводять до певних змін в амінокислотних послідовностях. Для ефективного конструювання білка із заданими властивостями необхідно знати закономірності формування просторової структури білка, від якої залежать його фізико-хімічні властивості та функції, тобто необхідно знати, як первинна структура білка, кожен його амінокислотний залишок впливає на властивості та функції білка. На жаль, більшість білків невідома третинна структура, який завжди буває відомо, яку саме амінокислоту чи послідовність амінокислот потрібно змінити, щоб отримати білок з потрібними властивостями. Вже зараз вчені з допомогою комп'ютерного аналізу можуть прогнозувати властивості багатьох білків, з послідовності їх амінокислотних залишків. Подібний аналіз спростить процедуру створення потрібних білків. Поки що для того, щоб отримати змінений білок з потрібними властивостями, йдуть переважно іншим шляхом: отримують кілька мутантних генів і знаходять той білковий продукт одного з них, який має потрібні властивості.
Для спрямованого мутагенезу використовують різні експериментальні підходи. Отримавши змінений ген, його вбудовують у генетичну конструкцію та вводять її в прокаріотичні або еукаріотичні клітини, що здійснюють синтез білка, що кодується цією генетичною конструкцією.
I. Білкова інженерія
1.1 Поняття білкової інженерії. Історія розвитку
Білкова інженерія (англ. Protein engineering) - розділ біотехнології, який займається розробкою корисних чи цінних білків. Це відносно нова дисципліна, яка спрямована на дослідження фолдингу білків та принципів модифікації та створення білків.
Існують дві основні стратегії для білкової інженерії: спрямована модифікація білка та спрямована еволюція. Ці методи є взаємовиключними; дослідники часто застосовують обидва. У майбутньому більш детальне знання структури та функції білків, а також досягнення в галузі високих технологій може значно розширити можливості білкової інженерії. У результаті навіть неприродні амінокислоти можуть бути включені завдяки новому методу, який дозволяє включати нові амінокислоти в генетичний код .
Білкова інженерія зародилася на стику фізики та хімії білка та генетичної інженерії. Вона вирішує завдання створення модифікованих чи гібридних молекул білків із заданими характеристиками. Природним шляхом реалізації такого завдання є передбачення структури гена, що кодує змінений білок, здійснення його синтезу, клонування та експресії у реципієнтних клітинах.
Першу контрольовану модифікацію білка було проведено в середині 60-х років Кошландом і Бендером. Для заміни гідроксильної групи на сульфгідрильну в активному центрі протеази - субтилізину вони застосували метод хімічної модифікації. Однак, як з'ясувалося, такий тіолсубтилізин не зберігає протеазної активності.
Білок у хімічному відношенні є однотипною молекулою, яка є поліамінокислотним ланцюжком або полімером. Складено він із амінокислотних послідовностей 20 типів. Дізнавшись будову білків, люди запитали: чи можна спроектувати абсолютно нові амінокислотні послідовності, щоб вони виконували потрібні людині функції набагато краще, ніж звичайні білки? Для цієї ідеї підійшла назва Білкова інженерія.
Про таку інженерію почали замислюватися ще у 50-ті роки XX століття. Сталося це відразу після розшифрування перших білкових амінокислотних послідовностей. У багатьох лабораторіях світу почали робити спроби дублювати природу та синтезувати хімічним шляхом задані абсолютно довільно поліамінокислотні послідовності.
Найбільше в цьому досяг успіху хімік Б. Мерріфілд. Цьому американцеві вдалося розробити надзвичайно ефективний метод синтезу поліамінокислотних ланцюгів. За це Мерріфілду в 1984 році присудили Нобелівську премію з хімії.
Малюнок 1. Схема функціонування білкової інженерії
Американець почав синтезувати короткі пептиди, включаючи гормони. При цьому побудував автомат - «хімічного робота» - завдання якого входило виробляє штучні білки. Робот викликав сенсацію у наукових колах. Однак незабаром з'ясувалося, що його продукція не може конкурувати з тим, що виробляє природа.
Робот не міг точно відтворювати амінокислотні послідовності, тобто помилявся. Він синтезував один ланцюг з однією послідовністю, а інший уже з трохи зміненим. У клітці всі молекули одного білка ідеально схожі одна на одну, тобто їх послідовності абсолютно однакові.
Була й інша проблема. Навіть ті молекули, які робот синтезував правильно, не набували тієї просторової форми, яка необхідна для функціонування ферменту. Таким чином, спроба підмінити природу звичайними методами органічної хімії призвела до скромного успіху.
Вченим залишалося навчатися у природи, шукаючи необхідні модифікації білків. Тут у тому, що у природі завжди йдуть мутації, які ведуть зміни амінокислотних послідовностей білків. Якщо відібрати мутантів з необхідними властивостями, які більш ефективно переробляють той чи інший субстрат, то можна виділити з такого мутанта змінений фермент, завдяки якому клітина набуває нових властивостей. Але цей процес займає дуже великий період.
Все змінилося тоді, коли виникла генна інженерія. Завдяки їй стали створювати штучні гени з будь-якою послідовністю нуклеотидів. Ці гени вбудовували в приготовлені молекули-вектори та впроваджували ці ДНК у бактерії чи дріжджі. Там із штучного гена знімалася копія РНК. Внаслідок цього вироблявся потрібний білок. Помилки у його синтезі виключалися. Головне, треба було підібрати потрібну послідовність ДНК, а далі вже ферментна система клітини сама бездоганно робила свою справу. Таким чином, можна зробити висновок, що генна інженерія відкрила шлях білкової інженерії в найрадикальнішій формі.
1.2 Стратегії білкової інженерії
Спрямована модифікація білка. При спрямованій модифікації білка вчений використовує детальне знання структури та функції білка, щоб зробити потрібні зміни. Як правило, цей метод має ту перевагу, що він недорогий і технічно нескладний, тому що техніка сайт-спрямованого мутагенезу добре розвинена. Однак, його основним недоліком є те, що відомості про докладну структуру білка часто відсутні, і навіть коли структура відома, може бути дуже важко передбачити вплив різних мутацій.
Програмні алгоритми модифікації білка прагнуть виявлення нових амінокислотних послідовностей, які вимагають мало енергії для формування зумовленої цільової структури. У той час як послідовність, яка має бути знайдена, велика, найбільш складною вимогою для модифікації білка є швидкий, але точний спосіб для виявлення та визначення оптимальної послідовності, на відміну її від аналогічних субоптимальних послідовностей .
Спрямована еволюція. У спрямованій еволюції довільний мутагенез застосовується до білка і селекція йде так, щоб вибрати варіанти, які мають певні якості. Далі застосовуються ще раунди мутації та селекції. Цей метод імітує природну еволюцію і дозволяє отримати чудові результати для спрямованої модифікації.
Додатковий метод, відомий як ДНК-перетасовування, змішує та виявляє частини вдалих варіантів для отримання кращих результатів. Цей процес імітує рекомбінації, що відбуваються природно під час статевого розмноження. Перевагою спрямованої еволюції є те, що вона не вимагає попередніх знань про структуру білка, та й не потрібно, щоб прогнозувати, який вплив дана мутація матиме. Насправді результати експериментів спрямованої еволюції дивують, оскільки бажані зміни часто бувають викликані мутаціями, які не повинні були мати такий ефект. Недоліком є те, що цей метод вимагає високої пропускної здатності, який не є можливим для всіх білків. Велика кількість рекомбінантної ДНК повинна бути мутована і необхідно провести скринінг продуктів на виявлення бажаної якості. Величезна кількість варіантів часто вимагає покупки робототехніки для автоматизації процесу. Крім того, не завжди легко провести скринінг на виявлення всіх цікавих якостей.
ІІ. Приклади інженерних білків
Білкова інженерія може бути заснована на хімічній модифікації готового білка або методах генетичної інженерії, що дозволяють отримувати модифіковані варіанти природних білків.
Конструювання певного біологічного каталізатора ведеться з урахуванням як специфічності білка, і каталітичної активності металоорганічного комплексу. Ось приклади такої модифікації, проведеної для отримання напівсинтетичних біоорганічних комплексів. Міоглобін кашалоту здатний зв'язувати кисень, але не має біокаталітичної активності. В результаті об'єднання цієї біомолекули з трьома електрон-переносними комплексами, що містять рутенії, які зв'язуються з залишками гістидину на поверхні молекул білка, утворюється комплекс, здатний відновлювати кисень при одночасному окисленні ряду органічних субстратів, наприклад аскорбату, зі швидкістю майже такою ж, як для природної аскорбатоксидази. У принципі, білки можна модифікувати й іншими способами. Розглянемо, наприклад, папаїн. Він належить до добре вивчених протеолітичних ферментів, для якого визначено тривимірну структуру. Поблизу залишку цистеїну-25 на поверхні білкової молекули розташовується протяжний жолобок, в якому протікає реакція протеолізу. Ця ділянка може бути алкільована похідним флавіна без зміни доступності ділянки зв'язування потенційних субстратів. Такі модифіковані флавопапаїни використовувалися для окислення М-алкіл-1,4-дигідронікотінамідів, і каталітична активність деяких з цих модифікованих білків була суттєво вищою, ніж у природних флавопротеїн-NADH-дегідрогеназ. У такий спосіб вдалося створити дуже ефективний напівсинтетичний фермент. Використання флавінів з високоактивними, які знаходяться у певному положенні електрон-відтягуючими заступниками, можливо дозволить розробити ефективні каталізатори для відновлення нікотин-аміду.
Великі успіхи, досягнуті останнім часом у хімічному синтезі ДНК, відкрили перед білковою інженерією принципово нові можливості: конструювання унікальних білків, що не зустрічаються в природі. Для цього необхідний і подальший розвиток технології, так щоб зміна генів методами генетичної інженерії призводила до передбачуваних змін білків, до поліпшення цілком певних функціональних характеристик: числа оборотів, Км для конкретного субстрату, термостабільності, температурного оптимуму, стабільності та активності в неводних розчинниках, субстратній та реакційної специфічності, потреби в кофакторах, оптимумі рН, стійкості до протеаз, алостеричної регуляції, молекулярної маси та субодиничної будови. Зазвичай такого поліпшення досягали за допомогою мутагенезу та відбору, а останнім часом – шляхом хімічної модифікації та іммобілізації. Для успішного конструювання конкретного типу молекул білка необхідно виявити ряд основних закономірностей, що пов'язують структурні особливості білків та їх бажані властивості. Так, знаючи точну кристалічну структуру молекули білка, що вивчається, можна ідентифікувати ті її ділянки, які слід спрямовано модифікувати для збільшення його каталітичної активності. Така модифікація може полягати у зміні амінокислотної послідовності білка.
Ще одним прикладом може бути здійснення сайт-специфічного мутагенезу. Він відбувається в такий спосіб. Клонують ген того білка, який цікавить дослідника, і вбудовують його у відповідний генетичний носій. Потім синтезують олігонуклеотидну затравку з бажаною мутацією, послідовність якої з десяти - п'ятнадцяти нуклеотидів достатньо гомологічна певному ділянці природного гена і тому здатна утворювати з ним гібридну структуру. Ця синтетична затравка використовується полімераз для початку синтезу комплементарної копії вектора, яку потім відокремлюють від оригіналу і використовують для контрольованого синтезу мутантного білка. Альтернативний підхід заснований на розщепленні ланцюга, видаленні сайту, що підлягає зміні, і заміщенні його синтетичним аналогом з бажаною послідовністю нуклеотидів.
Тирозил-тРНК-синтетаза каталізує реакцію аміноацилювання тирозинової тРНК, яка включає активування тирозину за допомогою АТР з утворенням тирозиладенілату. Ген цього ферменту, виділений з Bacillus stearothermophilus, був вбудований у бактеріофаг М13. Потім каталітичні властивості ферменту, особливо його здатність пов'язувати субстрат, були змінені шляхом сайт-специфічної модифікації. Так, треонін-51 замінили на аланін. Це призвело до дворазового збільшення зв'язування субстрату, мабуть, через неможливість утворення водневого зв'язку між цим залишком та тирозил-аденілатом. При заміні аланіну проліном порушується конфігурація молекули ферменту, але здатність до зв'язування субстрату збільшується у сто разів, оскільки полегшується його взаємодія з гістидином-48. Подібні сайт-специфічні зміни були отримані в р-лактамазі, і зазвичай вони супроводжувалися інактивацією ферменту. Заміна серину-70 на цистеїн призводить до утворення р-тіоллактамази, константа зв'язування у якої не відрізняється від такої для природного ферменту, але активність по відношенню до пеніциліну становить лише 1-2%. Проте активність цього мутантного ферменту щодо деяких активованих цефалоспоринів не менша від початкової активності або навіть перевищує її; ці білки також стійкіші до дії протеаз.
Мутації, що викликаються шляхом сайт-специфічного впливу, використовують сьогодні для перевірки адекватності результатів структурних досліджень. У деяких випадках з їхньою допомогою вдалося показати, що структурна стабільність білка та його каталітична активність можуть бути роз'єднані. Нагромадилася достатня кількість інформації про взаємозв'язок між стабільністю структури білка та його функцією, ми, можливо, зуміємо здійснювати тонке регулювання активності біологічних каталізаторів та створювати повністю синтетичні їх аналоги. Нещодавно з'явилася робота, в якій повідомлялося про клонування першого синтетичного гена ферменту, що кодує активний фрагмент молекули рибонуклеази.
ІІІ. Застосування білкової інженерії
Технологія білкової інженерії використовується (часто - у поєднанні з методом рекомбінантних ДНК) для поліпшення властивостей існуючих білків (ферментів, антитіл, клітинних рецепторів) і створення нових протеїнів, що не існують у природі. Такі білки застосовуються для створення лікарських препаратів, при обробці харчових продуктів та у промисловому виробництві.
Нині найпопулярнішою сферою застосування білкової інженерії є зміна каталітичних властивостей ферментів розробки «екологічно дружніх» промислових процесів. З погляду охорони навколишнього середовища ферменти є найбільш прийнятними з усіх каталізаторів, які у промисловості. Це забезпечується здатністю біокаталізаторів розчинятися у воді та повноцінно функціонувати в середовищі з нейтральним рН та при порівняно низьких температурах. Крім того, завдяки їх високій специфічності, в результаті застосування біокаталізаторів утворюється зовсім небагато побічних продуктів виробництва. Екологічно чисті та енергозберігаючі промислові процеси, що використовують біокаталізатори, вже давно активно впроваджуються хімічною, текстильною, фармацевтичною, целюлозно-паперовою, харчовою, енергетичною та іншими сферами сучасної промисловості.
Однак деякі характеристики біокаталізаторів роблять їх використання у ряді випадків неприйнятним. Наприклад, більшість ферментів розпадається у разі підвищення температури. Вчені намагаються подолати подібні перешкоди та збільшити стабільність ферментів у суворих умовах виробництва за допомогою методів білкової інженерії.
Крім промислового застосування, білкова інженерія знайшла собі гідне місце у медичних розробках. Дослідники синтезують білки, здатні зв'язуватися з вірусами та мутантними генами, що викликають пухлини, та знешкоджувати їх; створюють високоефективні вакцини та вивчають білки-рецептори клітинної поверхні, які часто є мішенями для фармацевтичних препаратів. Вчені, які займаються вдосконаленням продуктів харчування, використовують білкову інженерію для покращення якостей білків, що забезпечують збереження продуктів рослинного походження, а також желюючих речовин або загусників.
3.1 Бібліотеки пептидів та епітопів
У живому організмі більшість біологічних процесів управляється за допомогою специфічних білок-білкових або білково-нуклеїнових взаємодій. До таких процесів відносяться, наприклад, регуляція транскрипції генів під дією різних білкових факторів, взаємодія білкових лігандів з рецепторами на поверхні клітин, а також специфічне зв'язування антигенів відповідними антитілами. Розуміння молекулярних механізмів взаємодії білкових лігандів з рецепторами має велике фундаментальне та прикладне значення. Зокрема, розробка нових лікарських препаратів білкової природи зазвичай починається з ідентифікації вихідної послідовності амінокислот, що має необхідну біологічну активність (так звана "основна" (lead) послідовність). Однак пептиди з основною послідовністю амінокислот можуть мати і небажані біологічні властивості: низьку активність, токсичність, малу стабільність в організмі і т.п.
До появи бібліотек пептидів поліпшення їх біологічних властивостей здійснювали шляхом послідовного синтезу великої кількості аналогів та перевіркою їхньої біологічної активності, що вимагало великих витрат часу та засобів. Останніми роками з'явилася можливість з допомогою автоматичних синтезаторів створювати протягом короткого часу тисячі різних пептидів. Розроблені методи спрямованого мутагенезу також дозволили різко розширити кількість білків, одержуваних одночасно і тестуються послідовно на біологічну активність. Однак тільки недавно розроблені підходи до створення бібліотек пептидів призвели до отримання мільйонів послідовностей амінокислот, необхідних для проведення ефективного скринінгу з метою виявлення серед них пептидів, що максимально задовольняють критеріям, що висуваються. Такі бібліотеки використовуються для дослідження взаємодії антитіл з антигенами, отримання нових інгібіторів ферментів та антимікробних агентів, конструювання молекул, що мають необхідну біологічну активність, або надання нових властивостей білкам, наприклад антитілам.
За способами одержання бібліотеки пептидів поділяються на три групи. До першої групи можна віднести бібліотеки, одержані з використанням хімічного синтезу пептидів, у яких індивідуальні пептиди іммобілізовані на мікроносіях. При такому підході після приєднання чергових амінокислот в індивідуальних реакційних сумішах до пептидів, іммобілізованим на мікроносіях, вміст всіх реакційних сумішей об'єднують і поділяють на нові порції, які використовують на наступній стадії приєднання нових амінокислотних залишків. Після проведення низки таких етапів виявляються синтезованими пептиди, що містять послідовності використаних у синтезі амінокислот у різних випадкових поєднаннях.
Бібліотеки пептидів, іммобілізованих на мікроносіях, мають істотний недолік: вони вимагають при скринінгу використання очищених рецепторів, що знаходяться в розчинній формі. У той же час у більшості випадків при біологічних випробуваннях, що проводяться для фундаментальних та фармакологічних досліджень, найчастіше знаходять застосування рецептори, асоційовані з мембранами. За другим способом бібліотеки пептидів отримують за допомогою твердофазного синтезу пептидів, при якому на кожній стадії хімічного приєднання чергової амінокислоти до пептидних ланцюгів, що ростуть, використовують еквімолярні суміші всіх або деяких амінокислот-попередників. На кінцевій стадії синтезу проводять відокремлення пептидів від носія, тобто. переведення їх у розчинну форму. Третій підхід до конструювання бібліотек пептидів, до опису якого ми зараз переходимо, став реальним завдяки розвитку методів генної інженерії. Він чудово ілюструє можливості таких методів і, безперечно, є великим досягненням у їх застосуванні. У зв'язку з цим розглянемо докладніше результати використання бібліотек пептидів у дослідженні епітопів (антигенних детермінант) білків.
Генно-інженерна технологія отримання гібридних білків дозволила розробити ефективний метод напрацювання коротких пептидів для аналізу їхньої біологічної активності. Як і у випадку клонотек генів, бібліотеки пептидів, отримані генно-інженерними методами, є великим (часто вичерпним) набором коротких пептидів. Два недавно зроблені спостереження дозволяють розглядати бібліотеку пептидів одночасно і як бібліотеку епітопів білків. По-перше, короткі пептиди можуть включати всі основні залишки амінокислот, які відіграють головну роль у взаємодії з антитілами, і вони можуть імітувати великі антигенні детермінанти білків. По-друге, у більшості випадків нековалентні зв'язки, що утворюються між небагатьма найбільш важливими залишками амінокислот білкових лігандів та їх рецепторами, роблять основний внесок у загальну енергію взаємодії ліганд-рецептор. З огляду на це будь-який пептид можна розглядати як потенційний ліганд, гаптен або частину антигенної детермінанти більших поліпептидів, а будь-яку бібліотеку пептидів - як бібліотеку епітопів білків або потенційних лігандів для відповідних білкових рецепторів.
Бібліотека пептидів, отримана в результаті реалізації третього підходу, в сучасному вигляді являє собою набір десятків або навіть сотень мільйонів коротких послідовностей, що різняться, амінокислот, які експресовані на поверхні віріонів бактеріофагів у складі їх власних структурних білків. Це стає можливим завдяки введенню методами генної інженерії геном бактеріофагів гібридних рекомбінантних генів, що кодують змінені структурні білки його віріонів. (Цей метод відомий під назвою фагового дисплея.) В результаті експресії таких генів утворюються гібридні білки, на N або С-кінцях яких присутні додаткові послідовності амінокислот.
Бібліотеки пептидів та епітопів знайдуть своє застосування і у дослідженнях механізмів гуморальної імунної відповіді, а також захворювань імунної системи. Зокрема, більшість аутоімунних захворювань супроводжується утворенням аутоантитіл проти антигенів власного організму. Ці антитіла в багатьох випадках є специфічними маркерами того чи іншого аутоімунного захворювання. З використанням бібліотеки епітопів, в принципі, можна отримати пептидні маркери, за допомогою яких можна було б стежити за специфічністю аутоантитіл під час розвитку патологічного процесу як в індивідуальному організмі, так і в групі пацієнтів і, крім того, визначати специфічність аутоантитіл при захворюваннях невідомої етіології .
Бібліотеки пептидів та епітопів потенційно можуть бути використані також для скринінгу імунних сироваток з метою виявлення пептидів, що специфічно взаємодіють із захисними антитілами. Такі пептиди імітуватимуть антигенні детермінанти патогенних організмів та слугуватимуть мішенями для захисних антитіл організму. Це дозволить використовувати подібні пептиди для вакцинації пацієнтів, які не мають антитіла проти відповідних патогенів. Вивчення епітопів за допомогою бібліотек пептидів є окремим випадком одного з численних напрямів їх використання у прикладних та фундаментальних дослідженнях взаємодії лігандів та рецепторів. Подальше удосконалення цього підходу має сприяти створенню нових лікарських препаратів на основі коротких пептидів та бути корисним у фундаментальних дослідженнях механізмів білок-білкових взаємодій.
3.2 Білки-репортери у гібридних білках
В іншому випадку гібридні білки застосовують для отримання високого рівня експресії коротких пептидів у бактеріальних клітинах завдяки стабілізації цих пептидів у складі гібридних білків. Часто гібридні білки використовують для ідентифікації та очищення важковизначуваних рекомбінантних білків. Наприклад, приєднавши до С-кінця досліджуваного білка як білка-репортера галактозидазу, можна проводити очищення рекомбінантного білка за активністю галактозидази, визначаючи її антигенні детермінанти імунохімічними методами. Поєднуючи фрагменти ДНК, що містять відкриті рамки зчитування (ОРС), з генами білків-репортерів, можна очистити такі гібридні білки за активністю білка-репортера та використовувати їх для імунізації лабораторних тварин. Отримані антитіла далі застосовують для очищення нативного білка, до складу якого входить рекомбінантний поліпептид, що кодується ОРС, і цим ідентифікують клонований фрагмент гена .
За допомогою гібридних білків вирішують і обернену задачу клонування невідомого гена, до білкового продукту якого є антитіла. У такому випадку конструюють клонотеку послідовностей нуклеотидів, що представляють ОРС невідомих генів, у векторах, які дозволяють з'єднувати ОРС, що клонується, в одній рамці зчитування з геном-репортером. Гібридні білки, що утворюються в результаті експресії цих рекомбінантних генів, ідентифікуються за допомогою антитіл імуноферментними методами. Гібридні гени, що поєднують секретовані білки і білки-репортери, дають можливість по-новому досліджувати механізми секреції, а також локалізацію і переміщення в тканинах білків, що секретуються.
3.3 Деякі досягнення білкової інженерії
1. Замінивши кілька амінокислотних залишків лізоциму бактеріофага Т4 на цистеїн отримано фермент з великою кількістю дисульфідних зв'язків, завдяки чому цей фермент зберіг свою активність за більш високої температури.
2. Заміна залишку цистеїну на залишок серину в молекулі р-інтерферону людини, що синтезується кишковою паличкою, запобігала утворенню міжмолекулярних комплексів, при якому приблизно в 10 разів зменшувалася противірусна активність цього лікарського засобу.
3. Заміна залишку треоніну на залишок проліну в молекулі ферменту тирозил-тРНК-синтетази підвищило каталітичну активність цього ферменту в десятки разів: він став швидше приєднувати тирозин до тРНК, що переносить цю амінокислоту рибосому в ході трансляції.
4. Субтилізини - багаті на серин ферменти, що розщеплюють білки. Вони секретуються багатьма бактеріями та широко використовуються людиною для біодеградації. Вони міцно пов'язують атоми кальцію, що підвищують їхню стабільність. Однак у промислових процесах присутні хімічні сполуки, які зв'язують кальцій, після чого субтилізини втрачають свою активність. Змінивши ген, вчені видалили з ферменту амінокислоти, що беруть участь у зв'язуванні кальцію, та замінили одну амінокислоту на іншу з метою підвищення стабільності субтилізину. Змінений фермент виявився стабільним та функціонально активним в умовах, близьких до промислових.
5. Було показано можливість створення ферменту, що функціонує за типом рестриктаз, що розщеплюють ДНК у строго визначених місцях. Вчені створили гібридний білок, один фрагмент якого дізнавався певну послідовність нуклеотидних залишків у молекулі ДНК, а інший розщеплював ДНК у цій ділянці.
6. Активатор тканинного плазміногену – фермент, який використовують у клініці для розчинення згустків крові. На жаль, він швидко виводиться із системи кровообігу та його доводиться вводити повторно або у великих дозах, що призводить до побічних ефектів. Внісши три спрямовані мутації в ген цього ферменту, отримали довгоживучий фермент, що володіє підвищеною спорідненістю до фібрину, що руйнується, і з такою ж фібринолітичною активністю, як у вихідного ферменту.
7. Здійснивши заміну однієї амінокислоти в молекулі інсуліну, вчені домоглися того, що при підшкірному введенні цього гормону хворим, які страждають на діабет, зміна концентрації цього гормону в крові була близькою до фізіологічного, що виникає після прийому їжі.
8. Існує три класи інтерферонів, які мають противірусну та протиракову активність, але виявляють різну специфічність. Заманливо було створити гібридний інтерферон, що має властивості інтерферонів трьох типів. Були створені гібридні гени, що включають фрагменти природних генів інтерферонів декількох типів. Частина цих генів, будучи вбудованими в бактеріальні клітини, забезпечували синтез гібридних інтерферонів із більшою, ніж у батьківських молекул, протираковою активністю.
9. Природний гормон росту людини пов'язується не тільки з рецептором цього гормону, але і з рецептором іншого гормону – пролактину. Щоб уникнути небажаних побічних ефектів у процесі лікування, вчені вирішили усунути можливість приєднання гормону росту до пролактинового рецептора. Вони досягли цього, замінивши деякі амінокислоти в первинній структурі гормону росту за допомогою генетичної інженерії.
10. Розробляючи засоби проти ВІЛ-інфекції, вчені отримали гібридний білок, один фрагмент якого забезпечував специфічне зв'язування цього білка тільки з ураженими вірусом лімфоцитами, інший фрагмент здійснював проникнення гібридного білка всередину ураженої клітини, а ще один фрагмент порушував синтез білка в ураженій клітині призводило до її загибелі.
Білки є основною метою для лікарських засобів. Наразі відомо близько 500 мішеней для дії ліків. У найближчі роки їх кількість зросте до 10 000, що дозволить створити нові, ефективніші та безпечніші ліки. Останнім часом розробляються принципово нові підходи пошуку лікарських засобів: як мішені розглядаються не одиночні білки, а їх комплекси, білок-білкові взаємодії та фолдинг білків.
Висновок
Технологія білкової інженерії використовується (часто - у поєднанні з методом рекомбінантних ДНК) для поліпшення властивостей існуючих білків (ферментів, антитіл, клітинних рецепторів) і створення нових протеїнів, що не існують у природі. Такі білки застосовуються для створення лікарських препаратів, при обробці харчових продуктів та у промисловому виробництві.
Нині найпопулярнішою сферою застосування білкової інженерії є зміна каталітичних властивостей ферментів розробки «екологічно дружніх» промислових процесів. З погляду охорони навколишнього середовища ферменти є найбільш прийнятними з усіх каталізаторів, які у промисловості. Це забезпечується здатністю біокаталізаторів розчинятися у воді та повноцінно функціонувати в середовищі з нейтральним рН та при порівняно низьких температурах. Крім того, завдяки їх високій специфічності, в результаті застосування біокаталізаторів утворюється зовсім небагато побічних продуктів виробництва. Екологічно чисті та енергозберігаючі промислові процеси, що використовують біокаталізатори, вже давно активно впроваджуються хімічною, текстильною, фармацевтичною, целюлозно-паперовою, харчовою, енергетичною та іншими сферами сучасної промисловості.
Однак деякі характеристики біокаталізаторів роблять їх використання у ряді випадків неприйнятним. Наприклад, більшість ферментів розпадається у разі підвищення температури. Вчені намагаються подолати подібні перешкоди та збільшити стабільність ферментів у суворих умовах виробництва за допомогою методів білкової інженерії.
Крім промислового застосування, білкова інженерія знайшла собі гідне місце у медичних розробках. Дослідники синтезують білки, здатні зв'язуватися з вірусами та мутантними генами, що викликають пухлини, та знешкоджувати їх; створюють високоефективні вакцини та вивчають білки-рецептори клітинної поверхні, які часто є мішенями для фармацевтичних препаратів. Вчені, які займаються вдосконаленням продуктів харчування, використовують білкову інженерію для покращення якостей білків, що забезпечують збереження продуктів рослинного походження, а також желюючих речовин або загусників.
Ще однією сферою застосування білкової інженерії є створення білків, здатних нейтралізувати речовини та мікроорганізми, які можуть бути використані для хімічних та біологічних атак. Наприклад, ферменти гідролази здатні знешкоджувати як нервово-паралітичні гази, так і пестициди, що використовуються в сільському господарстві. При цьому виробництво, зберігання та використання ферментів не є небезпечним для навколишнього середовища та здоров'я людей.
білок інженерія модифікований мутагенез
Список літератури
1. Білкова інженерія.
2. Білкова інженерія. Загадки генетики. / В'ячеслав Маркін // Таємниці, загадки, факти.
3. Білкова інженерія. //Велика Російська енциклопедія.
4. Білкова інженерія. // Довідник хіміка 21.
5. Білкова інженерія та ефективність ліків.
6. Білкова інженерія. / А.І. Корнелюк//Biopolymers and Cell.
7. Білкова інженерія підвищить ефективність антибіотиків. // Популярна механіка.
8. Білкова інженерія. Одержання інсуліну. // Біофайл – науково-інформаційний журнал.
9. Біотехнологія. Основні напрямки та досягнення. // Біологія для абітурієнтів та вчителів.
10. Богданов А.А., Медніков Б.М. Влада над геном/А. А. Богданов, Б.М. Медніков - М.: Просвітництво, 1989 - с.208
11. Генна інженерія. // Здоров'я.
12. Гени та хіміки. // Генетика.
13. Глік Б., Пастернак Дж. Молекулярна біотехнологія. Принципи та застосування / Б. Глік, Дж. Пастернак. - М.: Світ, 2002.
14. Інші сфери застосування генної інженерії. / Л.В. Тимощенка, М.В. Чубик // Медицина - новини та технології.
15. Єгорова Т.А., Клунова С.М., Живухін Є.А. Основи біотехнології. / Т.А. Єгорова, С.М. Клунова, Є.А. Живухін - М., 2003.
16. Інженерія білка. // Хімія та біотехнологія.
17. Патрушев Л.І. Експресія генів/Л.І. Патрушев – М.: Наука, 2000. – 496с.
18. Патрушев Л.І. Штучні генетичні системи. Т. 1: Генна та білкова інженерія. / Л.І. Патрушев – М.: Наука, 2004. – 526 с.
19. Рибчин В.М. Основи генетичної інженерії: Підручник для вузів/В.М. Рибчин - СПб.: Вид-во СПбДТУ, 2002. - 522 с.
20. Степанов В.М. Молекулярна біологія Структури та функції білків. / В.М. Степанов - М.: Вища Школа, 1996.
21. Технології біотехнології: білкова інженерія, нанобіотехнологія, біосенсори та біочіпи. / Євгенія Рябцева // «Комерційна біотехнологія» – інтернет-журнал.
22. Чернавський Д.С., Чернавський Н.М. Білок-машина. Біологічні макромолекулярні конструкції. / Д.С. Чернавський, Н. М. Чернавська - М.: Изд-во МДУ, 1999.
23. Шульц Г.Є., Ширмер Р.Х. Принципи структурної організації білків. / Г.Є. Шульц, Р.Х. Ширмер - М.: Світ, 1982.
24. Brannigan J.А., Wilkinson А.J. Protein engineering 20 years on // Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2002. Vol. 3. № 12;
25. Protein engineering. // Wikipedia, free encyclopedia.
Розміщено на Allbest.ru
Подібні документи
Суть та завдання генної інженерії, історія її розвитку. Цілі створення генетично модифікованих організмів. Хімічне забруднення як наслідок ГМО. Отримання людського інсуліну як найважливіше досягнення у сфері генно-модифікованих організмів.
реферат, доданий 18.04.2013
Виникнення біотехнології. Основні напрямки біотехнології. Біоенергетика як розділ біотехнології. Практичні здобутки біотехнології. Історія генетичної інженерії. Цілі, методи та ферменти генної інженерії. Досягнення генетичної інженерії.
реферат, доданий 23.07.2008
Можливості генної інженерії рослин. Створення гербіцидостійких рослин. Підвищення ефективності фотосинтезу, біологічної азотфіксації. Поліпшення якості запасних білків. Екологічні, медичні та соціально-економічні ризики генної інженерії.
контрольна робота , доданий 15.12.2011
Сутність генетичної інженерії; методи ідентифікації трансгенних організмів; отримання та технологія ГМО, на відміну від традиційної селекції, переваги та недоліки. Стан та перспективні розвитку ринку генетично модифікованих товарів у світі.
курсова робота , доданий 20.11.2010
Генна інженерія - метод біотехнології, який займається дослідженнями з розбудови генотипів. Можливості генної інженерії. Перспективи генної інженерії. Зменшення ризику, пов'язаного із генними технологіями.
реферат, доданий 04.09.2007
Генна інженерія: історія виникнення, загальна характеристика, переваги та недоліки. Знайомство з новітніми методами генної інженерії, їх використання у медицині. Розробка генної інженерії в галузі тваринництва та птахівництва. Досліди на щурах.
курсова робота , доданий 11.07.2012
Послідовність прийомів генетичної інженерії, що використовується під час створення генетично модифікованих організмів. Класифікація основних типів рестриктаз, що використовуються для фрагментації ДНК. Ферменти, які синтезують ДНК на матриці ДНК або РНК.
презентація , доданий 27.04.2014
Сутність генної та клітинної інженерії. Основні завдання генної модифікації рослин, аналіз шкідливості їх споживання. Особливості гібридизації рослинних та тваринних клітин. Механізм одержання лікарських речовин за допомогою генної інженерії.
презентація , доданий 26.01.2014
курсова робота , доданий 10.05.2011
Основи та техніка клонування ДНК. Етапи генної інженерії бактерій. Розвиток генетичної інженерії рослин. Генетична трансформація та покращення рослин за допомогою агробактерій, джерела генів. Безпека генетично модифікованих рослин.
Словник Елюція Елюція – метод вилучення речовини (вірусу) з твердого носія вимиванням Метод дисплею Метод дисплею – метод представлення гетерологічних білків/пептидів на поверхні вірусів, клітин або безклітинних культур для відбору білків або пептидів з необхідними властивостями Біосенсор Біосенсор – ана ), що дозволяє виявляти речовини в досліджуваній пробі та оцінювати їх концентрації. Елюція Елюція – метод вилучення речовини (вірусу) з твердого носія вимиванням властивостями Біосенсор Біосенсор – аналітична система (біологічний матеріал + перетворювач), що дозволяє виявляти речовини в досліджуваній пробі та оцінювати їх концентрації
Білкова інженерія 4 Комплекс методів та підходів з вивчення білків та отримання білків з новими властивостями ОСНОВНІ ЗАДАЧІ Створити клонотеку нуклеотидних та амінокислотних послідовностей Дослідити впливу одиночних замін амінокислотних залишків на фолдинг та функції білка Розробити методи ефективності скринінгу та відбору білків з необхідними властивостями
Раціональний дизайн Раціональний дизайн Необхідність знань про просторову організацію білка Необхідність знань про внутрішньо- та міжмолекулярні взаємодії Недосконалість методик та апаратури напрямок, націлений на створення нових білків de novo шляхом їх просторового конструювання
Спрямована еволюція білкових молекул напрямок, націлений на створення нових білків, за допомогою селекції 1 отримання клонотек випадкових мутагенезу одержання нових клонотек з використанням генно-інженерних конструкцій, що експресують нові білки
Спрямована еволюція білкових молекул (варіанти) раціональний редизайн за допомогою спрямованого мутагенезу заміняють конкретні амінокислотні залишки в околицях амінокислотних залишків. ланцюги на значній відстані один від одного
Скринінг та відбір білків із заданими властивостями випадковий скринінг покращений скринінг відбір кожен білок досліджується на наявність необхідних властивостей; вибір білків із клонотеки відбувається випадково кожен білок досліджується на наявність необхідних властивостей; вибір білків з клонотеки відбувається випадково можливий, якщо об'єкти, що складають клонотеку, розрізняються фенотипно (наприклад, за наявністю ферментативної активності) створюються умови для вибіркового збереження компонентів клонотеки, які мають певні властивості (фаговий, клітинний дисплей) створюються умови для вибіркового збереження компонентів які мають певні властивості (фаговий, клітинний дисплей) виявлення білка з необхідними властивостями серед великої кількості макромолекул, що становлять отриману клонотеку
Фаговий дисплей Мета – експонувати чужорідні білки на поверхні фага Метод був розроблений у 1985 р. для нитчастого бактеріофага М13. (Гени pIII і pVIII є придатними сайтами мішенями для вставки чужорідного кДНК фрагмента) Мета - експонувати чужорідні білки на поверхні фага Метод був розроблений в 1985 р. для нитчастого бактеріофага М13. (гени pIII і pVIII є придатними сайтами мішенями для вставки чужорідного кДНК фрагмента) конструюють гібридний ген, що складається з кодуючих послідовностей цільового білка і одного з білків оболонки фага бактеріофагом інфікують E.coli в ході складання фага
Фагміда Фаг-помічник Геном фага Інфікування E.coli фагом-помічником клітини E.coli, трансформовані плазмідною бібліотекою / фагмідою, інфікують хелперним фагом для отримання фагових частинок, на поверхні яких експоновані різні варіанти цільового білка клітини E.coli, трансформ , інфікують хелперним фагом для отримання фагових частинок, на поверхні яких експоновані різні варіанти цільового білка
Перспективи практичного використання білкової інженерії Медицина: для отримання нових лікарських препаратів; для створення діагностичних засобів та виробництва вакцин; *Для дослідження механізмів імунної відповіді, а також захворювань імунної системи Екологія: *Для отримання біокаталізаторів у вигляді цілих клітин з іммобілізованими на їх поверхні ферментами; *для отримання біосенсорів з метою діагностики та моніторингу навколишнього середовища; *для створення біологічних адсорбентів з метою видалення з навколишнього середовища токсичних речовин та іонів важких металів
Вимірювання глюкози з допомогою ферментного електрода (схематичне уявлення досвіду Л. Кларка). Окислення глюкози ферментом глюкозооксидазою у присутності кисню: глюкоза + О 2 Н 2 О 2 + глюконо-1,5-лактон. Н 2 Про 2 відновлюється на платиновому електроді за потенціалу +700 мВ; струм, що протікає, пропорційний концентрації пероксиду водню (тобто, побічно, глюкози).
Словник Іммобілізація Іммобілізація – це обмеження рухливості молекул та їх конфірмаційних перебудов Аеротенк Аеротенк – система очищення стоків, резервуари в яких відбувається перемішування СВ, мікробного мулу та повітря Метантенк Метантенк – резервуар для біологічної переробки органічних забруднювачів очищення вод, грунтів та атмосфери з використанням метаболічного потенціалу біологічних об'єктів – рослин, грибів, комах, черв'яків та інших організмів Іммобілізація Іммобілізація – це обмеження рухливості молекул та їх конфірмаційних перебудов і повітря Метантенк Метантенк - резервуар для біологічної переробки органічних забруднювачів за допомогою бактерій в анаеробних умовах
Класифікація ферментів Клас Каталізовані реакції Приклади ферментів Оксидо-редуктази Відновлювальні та окислювальні реакції Відомо більше 200 ферментів. Каталаза, глюкооксидаза Трансферази Зворотне перенесення груп атомів від донорів до акцепторів. Відомо понад 450 ферментів. Піруваткиназа, протеїнкіназа Гідролази Реакції гідролізу Відомо понад 200 гідролазів. Протеаза, амілаза, целюлаза Ліази Негідролітичного відщеплення від субстрату груп атомів з утворенням подвійних зв'язків Відомо понад 100 ліаз. Аспартаза, фумараза Ізомерази Внутрішньомолекулярні реакції перебудови органічних сполук Відомо більше 50 ферментів. Глюкозоімераза Лігази Реакції приєднання один до одного двох різних молекул Відомо більше 100. ДНК-лігаза, триптофан-синтетаза
Мікроорганізми Джерела ферментів Бацили – біо синтезатори рибонуклеаз, дезоксирибонуклеаз та протеаз, а дріжджі – глюкоамілаз, інвертаз та кислої фос-фатази рослини Амілази виділяють з ячменю, кислу фосфатазу з картоплі, пероксидазу з хрену чну фосфатазу . Шлунок свиней використовують для отримання пепсину З серця ВРХ виділяють лактатдегідрогеназу, зі шлунка – лужну фосфатазу. Шлунок свиней використовують для отримання пепсину
Методи іммобілізації Фізичні методи Хімічні методи адсорбція на нерозчинному носії, включення в пори гелю, просторове відділення за допомогою напівпроникної мембрани та інші ґрунтується на створенні нових ковалентних зв'язків між ферментом та носієм
Переваги іммобілізованих ферментів відокремлювати ферменти від реакційного середовища, зупиняти реакцію у потрібний момент і отримувати продукт, не забруднений ферментом; проводити процес у безперервному режимі та регулювати швидкість реакції; змінювати властивості каталізатора, його специфічність, залежність від умов реакції та чутливість до денатуруючих впливів; регулювати каталітичну активність ферменту за допомогою впливу на носій
Ферменти у біотехнологічному виробництві Фермент Джерело, метод іммобілізації Біотехнологія Ацетилнейтрамінат-9-фосфатсинтаза Фермент E. coli. Включення у поліакриламідний гель. Синтез сіалових кислот. Пероксидаза Фермент із хрону. Сополімеризація та включення в гель альгінату. Окислення фенолу у стічних водах. 3-Кетостероїд-дегідрогеназу Клітини Mycobacterium globiformis. Включення у поліакриламідний гель. Трасформація гідрокортизону до преднізолону
Лавряшина М.Б. КемГУ Методи екологічної біотехнології Біологічне очищення стічних вод Біо(фіто)ремедіація Створення біобезпечних інсектицидів та гербіцидів Створення біобезпечних інсектицидів та гербіцидів Отримання екологічно чистої енергії Створення сільськогосподарських рослин стійких до хвороб Бактеріальне вилуговування металів Клонування
Методи очищення стічних вод Механічні (відстоювання, фільтрація) Механічні Хімічні (вплив реагентами) Хімічні Фізико-хімічні Біологічні (біохімічне самоочищення)) Біологічні
Аеротенки працюють у комплексі з усреднителем, відстійниками, регенератором мулу та ущільнювачем мулу (прес). Аеротенк Аеротенк (від аеро та англ. tank бак, цистерна) відстійник посередник АЕРОТЕНК регенератор мулу прес очищені стічні води активний мул стічні води метантенк
Метантенк Метантенк (від метан та англ. tank – бак, цистерна) Групи бактерій Вихідні речовини Продукти ГІДРОЛІТИЧНІ АЦЕТОГЕННІ Органічні забруднювачі Вищі жирні кислоти ВОДОРОДОПРОДУЦІЮЮЧІ ВИЩІ ЗОН 2 ІЕ Н 2, СО 2, СН 3 СООН СН 4, СО 2
Фази метанового бродіння 1 біогідроліз полімерів та ацидогенез (органічні речовини переходять у вищі жирні кислоти, ацетат і водень) 2 ацетогенез та дегідрогенізація (з вищих жирних кислот утворюється ацетат та водень) 3 Метаногенез (з ацетату утворюється метан, водень та вуглекислий газ)
І фаза. ЦЕЛЮЛОЗОРОЗРУШУЮЧІ (Bacterioides ruminicola, Butyrivibrio fibriosolvens) ПРОТЕОЛІТИЧНІ ПРОТЕОЛІТИЧНІ (Clostridium, Petrococcus) II фаза. АЦЕТОГЕННІ (Syntrophobacter wolinii) III фаза. МЕТАНООБРАЗУЮЧІ (Metanobacterium thermoautotrophicum, Metanococcus vannielii) Приклади мікроорганізмів
БІОРЕМЕДІАЦІЯ В основі методу лежить здатність мікроорганізмів утилізувати складні органічні речовини з розкладанням їх до простих «біологічно безпечних» речовин Молекулярна біологія та генетика Екологія Інженерні науки Мікро-біологія
Біоремедіація. Підходи. Використання активності природних «диких» мікроорганізмів Використання активності природних «диких» мікроорганізмів (потрібний інтенсифікатор, наприклад, Про 2) Використання активних штамів, внесених у вигляді біопрепаратів у місця інтенсивних забруднень
Вивчення біорізноманіття забруднених територій Виділення мікрофлори, здатної до деструкції забруднювачів, що видаляються Активізація місцевої мікрофлори (біостимуляція). Інтродукція у забруднені ділянки спеціальних мікроорганізмів-деструкторів (біоремедіація) Біоремедіація. Етапи.
Забруднення Хімічний аналіз Інженерні технології Біостимуляція (Природні мікробні співтовариства)Біостимуляція Біоремедіація (Штучні мікробні біопрепарати)Біоремедіація Моніторинг біоремедіації Біофіторемедіація (Спільноти рослин та мікроорганізмів)Біофіт
Конструювання трансгенних рослин, стійких проти комах шкідників 1. СИНТЕЗ СПЕЦИФІЧНИХ ТОКСИНІВ 2. СИНТЕЗ ГІДРОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТІВ, ЩО ДІЮТЬ НА КЛІТИННІ Стінки ЛИЧИНОК НАСИКОВИХ І ДРУКІВ - ДРУКІВНИХ ІДРУГІВ 1,3- ГЛЮКОНАЗИ, РR-БІЛКИ/ 3. СИНТЕЗ ІНГІБІТОРІВ ПРОТЕІНАЗ І ІНГІБІТОРІВ ФЕРМЕНТІВ, ЩО РОЗЩЕПЛЯЮТЬ ПОЛІСАХАРИДИ РОСЛИНИ 4. МОДИФІКАЦІЯ ВТОРИННОГО МЕТАБОЛІЗМУ РОСЛИН ДЛЯ: А) ЛІМІТУВАННЯ НЕОБХІДНИХ РЕЧОВИН Б). РЕГУЛЯЦІЯ ЗАХИСНОГО ВІДПОВІДІ: А) ТКАНЕСПЕЦИФІЧНА ЕКСПРЕСІЯ ГЕНІВ Б) РЕГУЛЯЦІЯ ЕКСПРЕСІЇ ГЕНІВ РІЗНИМИ ПРИРОДНИМИ І ШТУЧНИМИ ФАКТОРАМИ Підвищена стійкість трансгенних рослин до грибного патогену Phomopsis helianhi Підвищена стійкість трансгенних рослин до грибного патогену Phomopsis helianhi А B А - нетрансгенна рослина В - трансгенна рослина А - нетрансгенна рослина В - трансгенна рослина
Зразковий список тем, що входить до тесту на заліку 1. Історія біотехнології. Характеристика історичних періодів Найбільш значні відкриття, які зіграли значної ролі у становленні науки. 2. Загальні поняття біотехнології: біотехнологічна система, біотехнологічний процес, біотехнологічний об'єкт. 3. Біотехнологічні об'єкти, визначення, характеристика місця біооб'єкта у біотехнологічній системі, класифікація, приклади практичного застосування. 4. Мікроорганізми як біооб'єкти. Приклади, практичне використання у біотехнологіях. 5. Культури клітин та тканин як біооб'єкти. Приклади, практичне використання у біотехнологіях. 6. Біотехнологічний процес. Етапи. Коротка характеристика етапів біотехнологічного процесу. 7. Характеристика мікроорганізмів як об'єктів селекції. Селекція мікроорганізмів у біотехнології. 8. Мутагенез: визначення, форми мутагенезу, мутагенні фактори. 9. Відбір мутантних мікроорганізмів, створених у процесі селекції на підготовчій стадії біотехнологічного процесу. 10. Селекція біооб'єктів. Етапи, підходи, методи.
11. Генетична інженерія: ціль, техніка, біооб'єкти, приклади практичного застосування, сучасні досягнення. 12. Ферменти генетичної інженерії. Класифікація, характеристика реакцій, що каталізуються. 13. Методи отримання гена у генетичній інженерії. Коротка характеристика, переваги та недоліки методів. 14. Вектор у генетичній інженерії. Визначення, класифікація, вимоги, коротка характеристика векторів. 15. Рекомбінантна ДНК. Визначення, призначення, методи одержання рекомбінантної ДНК у генетичній інженерії. 16. Методи введення рекомбінантної ДНК у клітину-реципієнт та відбір модифікованих клітин у генетичній інженерії. 17. Трансгенез рослин. Вектор. Основні стратегії. Методи введення трансгенів та відбору трансгенних організмів. 18. Трансгенез тварин. Вектор. Основні стратегії. Методи введення трансгенів та відбору трансгенних організмів. 19. Клітинна інженерія: ціль, техніка, біооб'єкти, приклади практичного застосування, сучасні досягнення. 20. Методи культивування клітин та тканин рослин. Умови культивування, класифікація та коротка характеристика культур рослин у клітинній інженерії
21. Соматичні гібриди рослин. Техніка здобуття, сучасні досягнення, приклади практичного застосування. 22. Протопласти: визначення, використання в клітинній інженерії, методи та умови виділення протопластів. 23. Культивування та злиття протопластів у клітинній інженерії. Методи, умови, ф'юзогени. 24. Практичне використання культур клітин та тканин рослин. Біосинтез та біотрансформація, мікророзмноження, приклади трансгенних рослин з цінними властивостями. 25. Клітинна інженерія тварин. Методи, об'єкти, техніка, сучасні здобутки, практичне застосування. 26. Клітинні та тканинні культури тварин. Класифікації культур, умови культивування, середовища, методи одержання соматичних гібридів, практичне застосування. 27. Стовбурові клітини. Характеристики. Класифікація. Перспективи застосування. 28. Клонування. Характеристика методу. Класифікація. Перспективи застосування. 29. Біотехнологічний процес. Стадія культивування. Основні етапи, характеристика середовищ для мікроорганізмів, клітин рослин та тварин. Апаратура. 30. Біотехнологічний процес. Стадія культивування. Режими культивування біооб'єктів. Стадії зростання культури у біореакторі, синтез цільового продукту.
31. Біотехнологічний процес. Стадія одержання продукту. Основні етапи та методи відділення та очищення біотехнологічного продукту. Приклади біотехнологічних продуктів. 32. Екологічна біотехнологія: ціль, методи, біооб'єкти, приклади практичного застосування, сучасні досягнення. 33. Екологічна біотехнологія. Проблема питної води. Аеробні методи очищення стічних вод. 34. Екологічна біотехнологія. Проблема питної води. Анаеробні методи очищення стічних вод. 35. Екологічна біотехнологія. Біоремедіація, біофіторемедіація. 36. Біотехнологія: ціль, предмет, завдання, основні напрямки біотехнології. Сучасні досягнення у галузі біотехнології. 37. Інженерна ензимологія. Ціль, проблеми. Перспективи. Джерела ферментів. 38. Іммобілізовані ферменти. Переваги, методи іммобілізації. 39. Іммобілізовані ферменти. Носії для іммобілізації, практичне використання. 40. Білкова інженерія. Напрями, методи, перспективи.
Білкова інженерія (англ. Protein engineering) - розділ біотехнології, який займається розробкою корисних чи цінних білків. Це відносно нова дисципліна, яка спрямована на дослідження фолдингу білків та принципів модифікації та створення білків.
Існують дві основні стратегії для білкової інженерії: спрямована модифікація білка та спрямована еволюція. Ці методи є взаємовиключними; дослідники часто застосовують обидва. У майбутньому більш детальне знання структури та функції білків, а також досягнення в галузі високих технологій може значно розширити можливості білкової інженерії. У результаті навіть неприродні амінокислоти можуть бути включені завдяки новому методу, який дозволяє включати нові амінокислоти в генетичний код .
Білкова інженерія зародилася на стику фізики та хімії білка та генетичної інженерії. Вона вирішує завдання створення модифікованих чи гібридних молекул білків із заданими характеристиками. Природним шляхом реалізації такого завдання є передбачення структури гена, що кодує змінений білок, здійснення його синтезу, клонування та експресії у реципієнтних клітинах.
Першу контрольовану модифікацію білка було проведено в середині 60-х років Кошландом і Бендером. Для заміни гідроксильної групи на сульфгідрильну в активному центрі протеази - субтилізину вони застосували метод хімічної модифікації. Однак, як з'ясувалося, такий тіолсубтилізин не зберігає протеазної активності.
Білок у хімічному відношенні є однотипною молекулою, яка є поліамінокислотним ланцюжком або полімером. Складено він із амінокислотних послідовностей 20 типів. Дізнавшись будову білків, люди запитали: чи можна спроектувати абсолютно нові амінокислотні послідовності, щоб вони виконували потрібні людині функції набагато краще, ніж звичайні білки? Для цієї ідеї підійшла назва Білкова інженерія.
Про таку інженерію почали замислюватися ще у 50-ті роки XX століття. Сталося це відразу після розшифрування перших білкових амінокислотних послідовностей. У багатьох лабораторіях світу почали робити спроби дублювати природу та синтезувати хімічним шляхом задані абсолютно довільно поліамінокислотні послідовності.
Найбільше в цьому досяг успіху хімік Б. Мерріфілд. Цьому американцеві вдалося розробити надзвичайно ефективний метод синтезу поліамінокислотних ланцюгів. За це Мерріфілду в 1984 році присудили Нобелівську премію з хімії.
Малюнок 1. Схема функціонування білкової інженерії
Американець почав синтезувати короткі пептиди, включаючи гормони. При цьому побудував автомат - «хімічного робота» - завдання якого входило виробляє штучні білки. Робот викликав сенсацію у наукових колах. Однак незабаром з'ясувалося, що його продукція не може конкурувати з тим, що виробляє природа.
Робот не міг точно відтворювати амінокислотні послідовності, тобто помилявся. Він синтезував один ланцюг з однією послідовністю, а інший уже з трохи зміненим. У клітці всі молекули одного білка ідеально схожі одна на одну, тобто їх послідовності абсолютно однакові.
Була й інша проблема. Навіть ті молекули, які робот синтезував правильно, не набували тієї просторової форми, яка необхідна для функціонування ферменту. Таким чином, спроба підмінити природу звичайними методами органічної хімії призвела до скромного успіху.
Вченим залишалося навчатися у природи, шукаючи необхідні модифікації білків. Тут у тому, що у природі завжди йдуть мутації, які ведуть зміни амінокислотних послідовностей білків. Якщо відібрати мутантів з необхідними властивостями, які більш ефективно переробляють той чи інший субстрат, то можна виділити з такого мутанта змінений фермент, завдяки якому клітина набуває нових властивостей. Але цей процес займає дуже великий період.
Все змінилося тоді, коли виникла генна інженерія. Завдяки їй стали створювати штучні гени з будь-якою послідовністю нуклеотидів. Ці гени вбудовували в приготовлені молекули-вектори та впроваджували ці ДНК у бактерії чи дріжджі. Там із штучного гена знімалася копія РНК. Внаслідок цього вироблявся потрібний білок. Помилки у його синтезі виключалися. Головне, треба було підібрати потрібну послідовність ДНК, а далі вже ферментна система клітини сама бездоганно робила свою справу. Таким чином, можна зробити висновок, що генна інженерія відкрила шлях білкової інженерії в найрадикальнішій формі.
Стратегії білкової інженерії
Спрямована модифікація білка. При спрямованій модифікації білка вчений використовує детальне знання структури та функції білка, щоб зробити потрібні зміни. Як правило, цей метод має ту перевагу, що він недорогий і технічно нескладний, тому що техніка сайт-спрямованого мутагенезу добре розвинена. Однак, його основним недоліком є те, що відомості про докладну структуру білка часто відсутні, і навіть коли структура відома, може бути дуже важко передбачити вплив різних мутацій.
Програмні алгоритми модифікації білка прагнуть виявлення нових амінокислотних послідовностей, які вимагають мало енергії для формування зумовленої цільової структури. У той час як послідовність, яка має бути знайдена, велика, найбільш складною вимогою для модифікації білка є швидкий, але точний спосіб для виявлення та визначення оптимальної послідовності, на відміну її від аналогічних субоптимальних послідовностей .
Спрямована еволюція. У спрямованій еволюції довільний мутагенез застосовується до білка і селекція йде так, щоб вибрати варіанти, які мають певні якості. Далі застосовуються ще раунди мутації та селекції. Цей метод імітує природну еволюцію і дозволяє отримати чудові результати для спрямованої модифікації.
Додатковий метод, відомий як ДНК-перетасовування, змішує та виявляє частини вдалих варіантів для отримання кращих результатів. Цей процес імітує рекомбінації, що відбуваються природно під час статевого розмноження. Перевагою спрямованої еволюції є те, що вона не вимагає попередніх знань про структуру білка, та й не потрібно, щоб прогнозувати, який вплив дана мутація матиме. Насправді результати експериментів спрямованої еволюції дивують, оскільки бажані зміни часто бувають викликані мутаціями, які не повинні були мати такий ефект. Недоліком є те, що цей метод вимагає високої пропускної здатності, який не є можливим для всіх білків. Велика кількість рекомбінантної ДНК повинна бути мутована і необхідно провести скринінг продуктів на виявлення бажаної якості. Величезна кількість варіантів часто вимагає покупки робототехніки для автоматизації процесу. Крім того, не завжди легко провести скринінг на виявлення всіх цікавих якостей.
Курсова робота
з дисципліни: Сільськогосподарська біотехнологія
на тему: «Білкова інженерія»
Вступ. Білкова інженерія
1 Поняття білкової інженерії. Історія розвитку
2 Стратегії білкової інженерії. Приклад інженерних білків. Застосування білкової інженерії
1 Бібліотеки пептидів та епітопів
2 Білки-репортери у гібридних білках
3 Деякі досягнення білкової інженерії.
Висновок
Список літератури
Реферат
Тема роботи: Білкова інженерія.
Ключові слова: біотехнологія, генна інженерія, білок, генетичний код, ген, ДНК, РНК, АТФ, пептиди, епітоп.
Мета курсової роботи: вивчення поняття «білкова інженерія» та потенційних можливостей її використання.
Потенційні можливості білкової інженерії:
Змінивши міцність зв'язування речовини, що перетворюється, - субстрату - з ферментом, можна підвищити загальну каталітичну ефективність ферментативної реакції.
Підвищивши стабільність білка в широкому діапазоні температур та кислотності середовища, можна використовувати його в умовах, за яких вихідний білок денатурує та втрачає свою активність.
Створивши білки, здатні функціонувати безводних розчинниках, можна здійснювати каталітичні реакції в нефізіологічних умовах.
Змінивши каталітичний центр ферменту, можна підвищити його специфічність та зменшити кількість небажаних побічних реакцій
Підвищивши стійкість білка до ферментів, що його розщеплюють, можна спростити процедуру його очищення.
Змінивши білок таким чином, щоб він міг функціонувати без звичайного для нього амінокислотного компонента (вітаміну, атома металу тощо), можна використовувати його в деяких безперервних технологічних процесах.
Змінивши структуру регуляторних ділянок ферменту, можна зменшити ступінь його гальмування продуктом ферментативної реакції на кшталт негативної зворотний зв'язок і цим збільшити вихід продукту.
Можна створити гібридний білок, що має функції двох і більше білків.
Можна створити гібридний білок, одна з ділянок якого полегшує вихід гібридного білка з клітини, що культивується, або вилучення його з суміші.
Вступ
З давніх-давен біотехнологія застосовувалася переважно в харчовій і легкій промисловості: у виноробстві, хлібопеченні, зброджуванні молочних продуктів, при обробці льону і шкір, заснованих на застосуванні мікроорганізмів. Останні десятиліття можливості біотехнології надзвичайно розширилися. Це пов'язано з тим, що її методи вигідніші за звичайні з тієї простої причини, що в живих організмах біохімічні реакції, що каталізуються ферментами, йдуть за оптимальних умов (температури і тиску), більш продуктивні, екологічно чисті і не вимагають хімічних реактивів, що отруюють середовище.
Об'єктами біотехнології є численні представники груп живих організмів - мікроорганізми (віруси, бактерії, найпростіші, дріжджові гриби), рослини, тварини, і навіть ізольовані їх клітини і субклітинні компоненти (органели) і навіть ферменти. Біотехнологія базується на фізіолого-біохімічних процесах, що протікають в живих системах, в результаті яких здійснюються виділення енергії, синтез і розщеплення продуктів метаболізму, формування хімічних і структурних компонентів клітини.
Головним напрямком біотехнології є виробництво за допомогою мікроорганізмів та культивованих еукаріотичних клітин біологічно активних сполук (ферменти, вітаміни, гормони), лікарських препаратів (антибіотики, вакцини, сироватки, високоспецифічні антитіла та ін.), а також цінних сполук (кормові добавки амінокислоти, кормові білки і т. д.).
Методи генетичної інженерії дозволили здійснити синтез у промислових кількостях таких гормонів, як інсулін та соматотропін (гормон росту), які необхідні для лікування генетичних хвороб людини.
Біотехнологія вирішує не лише конкретні завдання науки та виробництва. Вона має більш глобальна методологічна завдання - вона розширює і прискорює масштаби впливу людини на живу природу і сприяє адаптації живих систем до умов існування людини, тобто до ноосфери. Біотехнологія, таким чином, виступає як потужний чинник антропогенної адаптивної еволюції.
У біотехнології, генетичної та клітинної інженерії перспективні перспективи. З появою нових і нових векторів людина з їх допомогою впроваджуватиме потрібні гени в клітини рослин, тварин і людини. Це дозволить поступово позбутися багатьох спадкових хвороб людини, змусити клітини синтезувати необхідні ліки та біологічно активні сполуки, а потім – безпосередньо білки та незамінні амінокислоти, які вживаються в їжу. Використовуючи методи, вже освоєні природою, біотехнологи сподіваються отримувати за допомогою фотосинтезу водень - екологічно чисте паливо майбутнього, електроенергію, перетворювати на аміак атмосферний азот за звичайних умов.
Фізичні та хімічні властивості природних білків часто не задовольняють умов, у яких ці білки будуть використовуватися людиною. Потрібна зміна його первинної структури, яка забезпечить формування білка з іншою, ніж раніше, просторовою структурою та новими фізико-хімічними властивостями, що дозволяють і в інших умовах виконувати властиві природному білку функції. Конструюванням білків займається білкова інженерія.
Ще однією сферою застосування білкової інженерії є створення білків, здатних нейтралізувати речовини та мікроорганізми, які можуть бути використані для хімічних та біологічних атак. Наприклад, ферменти гідролази здатні знешкоджувати як нервово-паралітичні гази, так і пестициди, що використовуються в сільському господарстві. При цьому виробництво, зберігання та використання ферментів не є небезпечним для навколишнього середовища та здоров'я людей.
Для отримання зміненого білка використовують методи комбінаторної хімії і здійснюють спрямований мутагенез - внесення специфічних змін кодуючі послідовності ДНК, що призводять до певних змін в амінокислотних послідовностях. Для ефективного конструювання білка із заданими властивостями необхідно знати закономірності формування просторової структури білка, від якої залежать його фізико-хімічні властивості та функції, тобто необхідно знати, як первинна структура білка, кожен його амінокислотний залишок впливає на властивості та функції білка. На жаль, більшість білків невідома третинна структура, який завжди буває відомо, яку саме амінокислоту чи послідовність амінокислот потрібно змінити, щоб отримати білок з потрібними властивостями. Вже зараз вчені з допомогою комп'ютерного аналізу можуть прогнозувати властивості багатьох білків, з послідовності їх амінокислотних залишків. Подібний аналіз спростить процедуру створення потрібних білків. Поки що для того, щоб отримати змінений білок з потрібними властивостями, йдуть переважно іншим шляхом: отримують кілька мутантних генів і знаходять той білковий продукт одного з них, який має потрібні властивості.
Для спрямованого мутагенезу використовують різні експериментальні підходи. Отримавши змінений ген, його вбудовують у генетичну конструкцію та вводять її в прокаріотичні або еукаріотичні клітини, що здійснюють синтез білка, що кодується цією генетичною конструкцією.
I. Білкова інженерія
1 Поняття білкової інженерії. Історія розвитку
Білкова інженерія (англ. Protein engineering) – розділ біотехнології, який займається розробкою корисних чи цінних білків. Це відносно нова дисципліна, яка спрямована на дослідження фолдингу білків та принципів модифікації та створення білків.
Існують дві основні стратегії для білкової інженерії: спрямована модифікація білка та спрямована еволюція. Ці методи є взаємовиключними; дослідники часто застосовують обидва. У майбутньому більш детальне знання структури та функції білків, а також досягнення в галузі високих технологій може значно розширити можливості білкової інженерії. У результаті навіть неприродні амінокислоти можуть бути включені завдяки новому методу, який дозволяє включати нові амінокислоти в генетичний код .
Білкова інженерія зародилася на стику фізики та хімії білка та генетичної інженерії. Вона вирішує завдання створення модифікованих чи гібридних молекул білків із заданими характеристиками. Природним шляхом реалізації такого завдання є передбачення структури гена, що кодує змінений білок, здійснення його синтезу, клонування та експресії у реципієнтних клітинах.
Першу контрольовану модифікацію білка було проведено в середині 60-х років Кошландом і Бендером. Для заміни гідроксильної групи на сульфгідрильну в активному центрі протеази - субтилізину вони застосували метод хімічної модифікації. Однак, як з'ясувалося, такий тіолсубтилізин не зберігає протеазної активності.
Білок у хімічному відношенні є однотипною молекулою, яка є поліамінокислотним ланцюжком або полімером. Складено він із амінокислотних послідовностей 20 типів. Дізнавшись будову білків, люди запитали: чи можна спроектувати абсолютно нові амінокислотні послідовності, щоб вони виконували потрібні людині функції набагато краще, ніж звичайні білки? Для цієї ідеї підійшла назва Білкова інженерія.
Про таку інженерію почали замислюватися ще у 50-ті роки XX століття. Сталося це відразу після розшифрування перших білкових амінокислотних послідовностей. У багатьох лабораторіях світу почали робити спроби дублювати природу та синтезувати хімічним шляхом задані абсолютно довільно поліамінокислотні послідовності.
Найбільше в цьому досяг успіху хімік Б. Мерріфілд. Цьому американцеві вдалося розробити надзвичайно ефективний метод синтезу поліамінокислотних ланцюгів. За це Мерріфілду в 1984 році присудили Нобелівську премію з хімії.
Малюнок 1. Схема функціонування білкової інженерії
Американець почав синтезувати короткі пептиди, включаючи гормони. При цьому побудував автомат - «хімічного робота» - завдання якого входило виробляє штучні білки. Робот викликав сенсацію у наукових колах. Однак незабаром з'ясувалося, що його продукція не може конкурувати з тим, що виробляє природа.
Робот не міг точно відтворювати амінокислотні послідовності, тобто помилявся. Він синтезував один ланцюг з однією послідовністю, а інший уже з трохи зміненим. У клітці всі молекули одного білка ідеально схожі одна на одну, тобто їх послідовності абсолютно однакові.
Була й інша проблема. Навіть ті молекули, які робот синтезував правильно, не набували тієї просторової форми, яка необхідна для функціонування ферменту. Таким чином, спроба підмінити природу звичайними методами органічної хімії призвела до скромного успіху.
Вченим залишалося навчатися у природи, шукаючи необхідні модифікації білків. Тут у тому, що у природі завжди йдуть мутації, які ведуть зміни амінокислотних послідовностей білків. Якщо відібрати мутантів з необхідними властивостями, які більш ефективно переробляють той чи інший субстрат, то можна виділити з такого мутанта змінений фермент, завдяки якому клітина набуває нових властивостей. Але цей процес займає дуже великий період.
Все змінилося тоді, коли виникла генна інженерія. Завдяки їй стали створювати штучні гени з будь-якою послідовністю нуклеотидів. Ці гени вбудовували в приготовлені молекули-вектори та впроваджували ці ДНК у бактерії чи дріжджі. Там із штучного гена знімалася копія РНК. Внаслідок цього вироблявся потрібний білок. Помилки у його синтезі виключалися. Головне, треба було підібрати потрібну послідовність ДНК, а далі вже ферментна система клітини сама бездоганно робила свою справу. Таким чином, можна зробити висновок, що генна інженерія відкрила шлях білкової інженерії в найрадикальнішій формі.
1.2 Стратегії білкової інженерії
Спрямована модифікація білка. При спрямованій модифікації білка вчений використовує детальне знання структури та функції білка, щоб зробити потрібні зміни. Як правило, цей метод має ту перевагу, що він недорогий і технічно нескладний, тому що техніка сайт-спрямованого мутагенезу добре розвинена. Однак, його основним недоліком є те, що відомості про докладну структуру білка часто відсутні, і навіть коли структура відома, може бути дуже важко передбачити вплив різних мутацій.
Програмні алгоритми модифікації білка прагнуть виявлення нових амінокислотних послідовностей, які вимагають мало енергії для формування зумовленої цільової структури. У той час як послідовність, яка має бути знайдена, велика, найбільш складною вимогою для модифікації білка є швидкий, але точний спосіб для виявлення та визначення оптимальної послідовності, на відміну її від аналогічних субоптимальних послідовностей .
Спрямована еволюція. У спрямованій еволюції довільний мутагенез застосовується до білка і селекція йде так, щоб вибрати варіанти, які мають певні якості. Далі застосовуються ще раунди мутації та селекції. Цей метод імітує природну еволюцію і дозволяє отримати чудові результати для спрямованої модифікації.
Додатковий метод, відомий як ДНК-перетасовування, змішує та виявляє частини вдалих варіантів для отримання кращих результатів. Цей процес імітує рекомбінації, що відбуваються природно під час статевого розмноження. Перевагою спрямованої еволюції є те, що вона не вимагає попередніх знань про структуру білка, та й не потрібно, щоб прогнозувати, який вплив дана мутація матиме. Насправді результати експериментів спрямованої еволюції дивують, оскільки бажані зміни часто бувають викликані мутаціями, які не повинні були мати такий ефект. Недоліком є те, що цей метод вимагає високої пропускної здатності, який не є можливим для всіх білків. Велика кількість рекомбінантної ДНК повинна бути мутована і необхідно провести скринінг продуктів на виявлення бажаної якості. Величезна кількість варіантів часто вимагає покупки робототехніки для автоматизації процесу. Крім того, не завжди легко провести скринінг на виявлення всіх цікавих якостей.
ІІ. Приклади інженерних білків
Білкова інженерія може бути заснована на хімічній модифікації готового білка або методах генетичної інженерії, що дозволяють отримувати модифіковані варіанти природних білків.
Конструювання певного біологічного каталізатора ведеться з урахуванням як специфічності білка, і каталітичної активності металоорганічного комплексу. Ось приклади такої модифікації, проведеної для отримання напівсинтетичних біоорганічних комплексів. Міоглобін кашалоту здатний зв'язувати кисень, але не має біокаталітичної активності. В результаті об'єднання цієї біомолекули з трьома електрон-переносними комплексами, що містять рутенії, які зв'язуються з залишками гістидину на поверхні молекул білка, утворюється комплекс, здатний відновлювати кисень при одночасному окисленні ряду органічних субстратів, наприклад аскорбату, зі швидкістю майже такою ж, як для природної аскорбатоксидази. У принципі, білки можна модифікувати й іншими способами. Розглянемо, наприклад, папаїн. Він належить до добре вивчених протеолітичних ферментів, для якого визначено тривимірну структуру. Поблизу залишку цистеїну-25 на поверхні білкової молекули розташовується протяжний жолобок, в якому протікає реакція протеолізу. Ця ділянка може бути алкільована похідним флавіна без зміни доступності ділянки зв'язування потенційних субстратів. Такі модифіковані флавопапаїни використовувалися для окислення М-алкіл-1,4-дигідронікотінамідів, і каталітична активність деяких з цих модифікованих білків була суттєво вищою, ніж у природних флавопротеїн-NADH-дегідрогеназ. У такий спосіб вдалося створити дуже ефективний напівсинтетичний фермент. Використання флавінів з високоактивними, які знаходяться у певному положенні електрон-відтягуючими заступниками, можливо дозволить розробити ефективні каталізатори для відновлення нікотин-аміду.
Великі успіхи, досягнуті останнім часом у хімічному синтезі ДНК, відкрили перед білковою інженерією принципово нові можливості: конструювання унікальних білків, що не зустрічаються в природі. Для цього необхідний і подальший розвиток технології, так щоб зміна генів методами генетичної інженерії призводила до передбачуваних змін білків, до поліпшення цілком певних функціональних характеристик: числа оборотів, Км для конкретного субстрату, термостабільності, температурного оптимуму, стабільності та активності в неводних розчинниках, субстратній та реакційної специфічності, потреби в кофакторах, оптимумі рН, стійкості до протеаз, алостеричної регуляції, молекулярної маси та субодиничної будови. Зазвичай такого поліпшення досягали за допомогою мутагенезу та відбору, а останнім часом – шляхом хімічної модифікації та іммобілізації. Для успішного конструювання конкретного типу молекул білка необхідно виявити ряд основних закономірностей, що пов'язують структурні особливості білків та їх бажані властивості. Так, знаючи точну кристалічну структуру молекули білка, що вивчається, можна ідентифікувати ті її ділянки, які слід спрямовано модифікувати для збільшення його каталітичної активності. Така модифікація може полягати у зміні амінокислотної послідовності білка.
Ще одним прикладом може бути здійснення сайт-специфічного мутагенезу. Він відбувається в такий спосіб. Клонують ген того білка, який цікавить дослідника, і вбудовують його у відповідний генетичний носій. Потім синтезують олігонуклеотидну затравку з бажаною мутацією, послідовність якої з десяти - п'ятнадцяти нуклеотидів достатньо гомологічна певному ділянці природного гена і тому здатна утворювати з ним гібридну структуру. Ця синтетична затравка використовується полімераз для початку синтезу комплементарної копії вектора, яку потім відокремлюють від оригіналу і використовують для контрольованого синтезу мутантного білка. Альтернативний підхід заснований на розщепленні ланцюга, видаленні сайту, що підлягає зміні, і заміщенні його синтетичним аналогом з бажаною послідовністю нуклеотидів.
Тирозил-тРНК-синтетаза каталізує реакцію аміноацилювання тирозинової тРНК, яка включає активування тирозину за допомогою АТР з утворенням тирозиладенілату. Ген цього ферменту, виділений з Bacillus stearothermophilus, був вбудований у бактеріофаг М13. Потім каталітичні властивості ферменту, особливо його здатність пов'язувати субстрат, були змінені шляхом сайт-специфічної модифікації. Так, треонін-51 замінили на аланін. Це призвело до дворазового збільшення зв'язування субстрату, мабуть, через неможливість утворення водневого зв'язку між цим залишком та тирозил-аденілатом. При заміні аланіну проліном порушується конфігурація молекули ферменту, але здатність до зв'язування субстрату збільшується у сто разів, оскільки полегшується його взаємодія з гістидином-48. Подібні сайт-специфічні зміни були отримані в р-лактамазі, і зазвичай вони супроводжувалися інактивацією ферменту. Заміна серину-70 на цистеїн призводить до утворення р-тіоллактамази, константа зв'язування у якої не відрізняється від такої для природного ферменту, але активність по відношенню до пеніциліну становить лише 1-2%. Проте активність цього мутантного ферменту щодо деяких активованих цефалоспоринів не менша від початкової активності або навіть перевищує її; ці білки також стійкіші до дії протеаз.
Мутації, що викликаються шляхом сайт-специфічного впливу, використовують сьогодні для перевірки адекватності результатів структурних досліджень. У деяких випадках з їхньою допомогою вдалося показати, що структурна стабільність білка та його каталітична активність можуть бути роз'єднані. Нагромадилася достатня кількість інформації про взаємозв'язок між стабільністю структури білка та його функцією, ми, можливо, зуміємо здійснювати тонке регулювання активності біологічних каталізаторів та створювати повністю синтетичні їх аналоги. Нещодавно з'явилася робота, в якій повідомлялося про клонування першого синтетичного гена ферменту, що кодує активний фрагмент молекули рибонуклеази.
ІІІ. Застосування білкової інженерії
Нині найпопулярнішою сферою застосування білкової інженерії є зміна каталітичних властивостей ферментів розробки «екологічно дружніх» промислових процесів. З погляду охорони навколишнього середовища ферменти є найбільш прийнятними з усіх каталізаторів, які у промисловості. Це забезпечується здатністю біокаталізаторів розчинятися у воді та повноцінно функціонувати в середовищі з нейтральним рН та при порівняно низьких температурах. Крім того, завдяки їх високій специфічності, в результаті застосування біокаталізаторів утворюється зовсім небагато побічних продуктів виробництва. Екологічно чисті та енергозберігаючі промислові процеси, що використовують біокаталізатори, вже давно активно впроваджуються хімічною, текстильною, фармацевтичною, целюлозно-паперовою, харчовою, енергетичною та іншими сферами сучасної промисловості.
Однак деякі характеристики біокаталізаторів роблять їх використання у ряді випадків неприйнятним. Наприклад, більшість ферментів розпадається у разі підвищення температури. Вчені намагаються подолати подібні перешкоди та збільшити стабільність ферментів у суворих умовах виробництва за допомогою методів білкової інженерії.
Крім промислового застосування, білкова інженерія знайшла собі гідне місце у медичних розробках. Дослідники синтезують білки, здатні зв'язуватися з вірусами та мутантними генами, що викликають пухлини, та знешкоджувати їх; створюють високоефективні вакцини та вивчають білки-рецептори клітинної поверхні, які часто є мішенями для фармацевтичних препаратів. Вчені, які займаються вдосконаленням продуктів харчування, використовують білкову інженерію для покращення якостей білків, що забезпечують збереження продуктів рослинного походження, а також желюючих речовин або загусників.
Ще однією сферою застосування білкової інженерії є створення білків, здатних нейтралізувати речовини та мікроорганізми, які можуть бути використані для хімічних та біологічних атак. Наприклад, ферменти гідролази здатні знешкоджувати як нервово-паралітичні гази, так і пестициди, що використовуються в сільському господарстві. При цьому виробництво, зберігання та використання ферментів не є небезпечним для навколишнього середовища та здоров'я людей.
3.1 Бібліотеки пептидів та епітопів
У живому організмі більшість біологічних процесів управляється за допомогою специфічних білок-білкових або білково-нуклеїнових взаємодій. До таких процесів відносяться, наприклад, регуляція транскрипції генів під дією різних білкових факторів, взаємодія білкових лігандів з рецепторами на поверхні клітин, а також специфічне зв'язування антигенів відповідними антитілами. Розуміння молекулярних механізмів взаємодії білкових лігандів з рецепторами має велике фундаментальне та прикладне значення. Зокрема, розробка нових лікарських препаратів білкової природи зазвичай починається з ідентифікації вихідної послідовності амінокислот, що має необхідну біологічну активність (так звана "основна" (lead) послідовність). Однак пептиди з основною послідовністю амінокислот можуть мати і небажані біологічні властивості: низьку активність, токсичність, малу стабільність в організмі і т.п.
До появи бібліотек пептидів поліпшення їх біологічних властивостей здійснювали шляхом послідовного синтезу великої кількості аналогів та перевіркою їхньої біологічної активності, що вимагало великих витрат часу та засобів. Останніми роками з'явилася можливість з допомогою автоматичних синтезаторів створювати протягом короткого часу тисячі різних пептидів. Розроблені методи спрямованого мутагенезу також дозволили різко розширити кількість білків, одержуваних одночасно і тестуються послідовно на біологічну активність. Однак тільки недавно розроблені підходи до створення бібліотек пептидів призвели до отримання мільйонів послідовностей амінокислот, необхідних для проведення ефективного скринінгу з метою виявлення серед них пептидів, що максимально задовольняють критеріям, що висуваються. Такі бібліотеки використовуються для дослідження взаємодії антитіл з антигенами, отримання нових інгібіторів ферментів та антимікробних агентів, конструювання молекул, що мають необхідну біологічну активність, або надання нових властивостей білкам, наприклад антитілам.
За способами одержання бібліотеки пептидів поділяються на три групи. До першої групи можна віднести бібліотеки, одержані з використанням хімічного синтезу пептидів, у яких індивідуальні пептиди іммобілізовані на мікроносіях. При такому підході після приєднання чергових амінокислот в індивідуальних реакційних сумішах до пептидів, іммобілізованим на мікроносіях, вміст всіх реакційних сумішей об'єднують і поділяють на нові порції, які використовують на наступній стадії приєднання нових амінокислотних залишків. Після проведення низки таких етапів виявляються синтезованими пептиди, що містять послідовності використаних у синтезі амінокислот у різних випадкових поєднаннях.
Бібліотеки пептидів, іммобілізованих на мікроносіях, мають істотний недолік: вони вимагають при скринінгу використання очищених рецепторів, що знаходяться в розчинній формі. У той же час у більшості випадків при біологічних випробуваннях, що проводяться для фундаментальних та фармакологічних досліджень, найчастіше знаходять застосування рецептори, асоційовані з мембранами. За другим способом бібліотеки пептидів отримують за допомогою твердофазного синтезу пептидів, при якому на кожній стадії хімічного приєднання чергової амінокислоти до пептидних ланцюгів, що ростуть, використовують еквімолярні суміші всіх або деяких амінокислот-попередників. На кінцевій стадії синтезу проводять відокремлення пептидів від носія, тобто. переведення їх у розчинну форму. Третій підхід до конструювання бібліотек пептидів, до опису якого ми зараз переходимо, став реальним завдяки розвитку методів генної інженерії. Він чудово ілюструє можливості таких методів і, безперечно, є великим досягненням у їх застосуванні. У зв'язку з цим розглянемо докладніше результати використання бібліотек пептидів у дослідженні епітопів (антигенних детермінант) білків.
Генно-інженерна технологія отримання гібридних білків дозволила розробити ефективний метод напрацювання коротких пептидів для аналізу їхньої біологічної активності. Як і у випадку клонотек генів, бібліотеки пептидів, отримані генно-інженерними методами, є великим (часто вичерпним) набором коротких пептидів. Два недавно зроблені спостереження дозволяють розглядати бібліотеку пептидів одночасно і як бібліотеку епітопів білків. По-перше, короткі пептиди можуть включати всі основні залишки амінокислот, які відіграють головну роль у взаємодії з антитілами, і вони можуть імітувати великі антигенні детермінанти білків. По-друге, у більшості випадків нековалентні зв'язки, що утворюються між небагатьма найбільш важливими залишками амінокислот білкових лігандів та їх рецепторами, роблять основний внесок у загальну енергію взаємодії ліганд-рецептор. З огляду на це будь-який пептид можна розглядати як потенційний ліганд, гаптен або частину антигенної детермінанти більших поліпептидів, а будь-яку бібліотеку пептидів - як бібліотеку епітопів білків або потенційних лігандів для відповідних білкових рецепторів.
Бібліотека пептидів, отримана в результаті реалізації третього підходу, в сучасному вигляді являє собою набір десятків або навіть сотень мільйонів коротких послідовностей, що різняться, амінокислот, які експресовані на поверхні віріонів бактеріофагів у складі їх власних структурних білків. Це стає можливим завдяки введенню методами генної інженерії геном бактеріофагів гібридних рекомбінантних генів, що кодують змінені структурні білки його віріонів. (Цей метод відомий під назвою фагового дисплея.) В результаті експресії таких генів утворюються гібридні білки, на N або С-кінцях яких присутні додаткові послідовності амінокислот.
Бібліотеки пептидів та епітопів знайдуть своє застосування і у дослідженнях механізмів гуморальної імунної відповіді, а також захворювань імунної системи. Зокрема, більшість аутоімунних захворювань супроводжується утворенням аутоантитіл проти антигенів власного організму. Ці антитіла в багатьох випадках є специфічними маркерами того чи іншого аутоімунного захворювання. З використанням бібліотеки епітопів, в принципі, можна отримати пептидні маркери, за допомогою яких можна було б стежити за специфічністю аутоантитіл під час розвитку патологічного процесу як в індивідуальному організмі, так і в групі пацієнтів і, крім того, визначати специфічність аутоантитіл при захворюваннях невідомої етіології .
Бібліотеки пептидів та епітопів потенційно можуть бути використані також для скринінгу імунних сироваток з метою виявлення пептидів, що специфічно взаємодіють із захисними антитілами. Такі пептиди імітуватимуть антигенні детермінанти патогенних організмів та слугуватимуть мішенями для захисних антитіл організму. Це дозволить використовувати подібні пептиди для вакцинації пацієнтів, які не мають антитіла проти відповідних патогенів. Вивчення епітопів за допомогою бібліотек пептидів є окремим випадком одного з численних напрямів їх використання у прикладних та фундаментальних дослідженнях взаємодії лігандів та рецепторів. Подальше удосконалення цього підходу має сприяти створенню нових лікарських препаратів на основі коротких пептидів та бути корисним у фундаментальних дослідженнях механізмів білок-білкових взаємодій.
3.2 Білки-репортери у гібридних білках
В іншому випадку гібридні білки застосовують для отримання високого рівня експресії коротких пептидів у бактеріальних клітинах завдяки стабілізації цих пептидів у складі гібридних білків. Часто гібридні білки використовують для ідентифікації та очищення важковизначуваних рекомбінантних білків. Наприклад, приєднавши до С-кінця досліджуваного білка як білка-репортера галактозидазу, можна проводити очищення рекомбінантного білка за активністю галактозидази, визначаючи її антигенні детермінанти імунохімічними методами. Поєднуючи фрагменти ДНК, що містять відкриті рамки зчитування (ОРС), з генами білків-репортерів, можна очистити такі гібридні білки за активністю білка-репортера та використовувати їх для імунізації лабораторних тварин. Отримані антитіла далі застосовують для очищення нативного білка, до складу якого входить рекомбінантний поліпептид, що кодується ОРС, і цим ідентифікують клонований фрагмент гена .
За допомогою гібридних білків вирішують і обернену задачу клонування невідомого гена, до білкового продукту якого є антитіла. У такому випадку конструюють клонотеку послідовностей нуклеотидів, що представляють ОРС невідомих генів, у векторах, які дозволяють з'єднувати ОРС, що клонується, в одній рамці зчитування з геном-репортером. Гібридні білки, що утворюються в результаті експресії цих рекомбінантних генів, ідентифікуються за допомогою антитіл імуноферментними методами. Гібридні гени, що поєднують секретовані білки і білки-репортери, дають можливість по-новому досліджувати механізми секреції, а також локалізацію і переміщення в тканинах білків, що секретуються.
3.3 Деякі досягнення білкової інженерії
Замінивши кілька амінокислотних залишків лізоциму бактеріофага Т4 на цистеїн отримано фермент з великою кількістю дисульфідних зв'язків, завдяки чому цей фермент зберіг свою активність за більш високої температури.
Заміна залишку цистеїну на залишок серину в молекулі р-інтерферону людини, що синтезується кишковою паличкою, запобігала утворенню міжмолекулярних комплексів, при якому приблизно в 10 разів зменшувалася противірусна активність цього лікарського засобу.
Заміна залишку треоніну на залишок проліну в молекулі ферменту тирозил-тРНК-синтетази підвищило каталітичну активність цього ферменту в десятки разів: він став швидше приєднувати тирозин до тРНК, що переносить цю амінокислоту рибосому в ході трансляції.
Субтилізини - багаті на серин ферменти, що розщеплюють білки. Вони секретуються багатьма бактеріями та широко використовуються людиною для біодеградації. Вони міцно пов'язують атоми кальцію, що підвищують їхню стабільність. Однак у промислових процесах присутні хімічні сполуки, які зв'язують кальцій, після чого субтилізини втрачають свою активність. Змінивши ген, вчені видалили з ферменту амінокислоти, що беруть участь у зв'язуванні кальцію, та замінили одну амінокислоту на іншу з метою підвищення стабільності субтилізину. Змінений фермент виявився стабільним та функціонально активним в умовах, близьких до промислових.
Була показана можливість створення ферменту, що функціонує на кшталт рестриктаз, що розщеплюють ДНК у строго визначених місцях. Вчені створили гібридний білок, один фрагмент якого дізнавався певну послідовність нуклеотидних залишків у молекулі ДНК, а інший розщеплював ДНК у цій ділянці.
Активатор тканинного плазміногену – фермент, який використовують у клініці для розчинення згустків крові. На жаль, він швидко виводиться із системи кровообігу та його доводиться вводити повторно або у великих дозах, що призводить до побічних ефектів. Внісши три спрямовані мутації в ген цього ферменту, отримали довгоживучий фермент, що володіє підвищеною спорідненістю до фібрину, що руйнується, і з такою ж фібринолітичною активністю, як у вихідного ферменту.
Зробивши заміну однієї амінокислоти в молекулі інсуліну, вчені домоглися того, що при підшкірному введенні цього гормону хворим, які страждають на діабет, зміна концентрації цього гормону в крові була близько до фізіологічного, що виникає після їди.
Існує три класи інтерферонів, які мають противірусну та протиракову активність, але виявляють різну специфічність. Заманливо було створити гібридний інтерферон, що має властивості інтерферонів трьох типів. Були створені гібридні гени, що включають фрагменти природних генів інтерферонів декількох типів. Частина цих генів, будучи вбудованими в бактеріальні клітини, забезпечували синтез гібридних інтерферонів із більшою, ніж у батьківських молекул, протираковою активністю.
Природний гормон росту людини пов'язується не тільки з рецептором цього гормону, але і з рецептором іншого гормону – пролактину. Щоб уникнути небажаних побічних ефектів у процесі лікування, вчені вирішили усунути можливість приєднання гормону росту до пролактинового рецептора. Вони досягли цього, замінивши деякі амінокислоти в первинній структурі гормону росту за допомогою генетичної інженерії.
Розробляючи засоби проти ВІЛ-інфекції, вчені отримали гібридний білок, один фрагмент якого забезпечував специфічне зв'язування цього білка тільки з ураженими вірусом лімфоцитами, інший фрагмент здійснював проникнення гібридного білка всередину ураженої клітини, а ще один фрагмент порушував синтез білка в ураженій клітині її загибелі.
Білки є основною метою для лікарських засобів. Наразі відомо близько 500 мішеней для дії ліків. У найближчі роки їх кількість зросте до 10 000, що дозволить створити нові, ефективніші та безпечніші ліки. Останнім часом розробляються принципово нові підходи пошуку лікарських засобів: як мішені розглядаються не одиночні білки, а їх комплекси, білок-білкові взаємодії та фолдинг білків.
Висновок
Технологія білкової інженерії використовується (часто - у поєднанні з методом рекомбінантних ДНК) для поліпшення властивостей існуючих білків (ферментів, антитіл, клітинних рецепторів) і створення нових протеїнів, що не існують у природі. Такі білки застосовуються для створення лікарських препаратів, при обробці харчових продуктів та у промисловому виробництві.
Нині найпопулярнішою сферою застосування білкової інженерії є зміна каталітичних властивостей ферментів розробки «екологічно дружніх» промислових процесів. З погляду охорони навколишнього середовища ферменти є найбільш прийнятними з усіх каталізаторів, які у промисловості. Це забезпечується здатністю біокаталізаторів розчинятися у воді та повноцінно функціонувати в середовищі з нейтральним рН та при порівняно низьких температурах. Крім того, завдяки їх високій специфічності, в результаті застосування біокаталізаторів утворюється зовсім небагато побічних продуктів виробництва. Екологічно чисті та енергозберігаючі промислові процеси, що використовують біокаталізатори, вже давно активно впроваджуються хімічною, текстильною, фармацевтичною, целюлозно-паперовою, харчовою, енергетичною та іншими сферами сучасної промисловості.
Однак деякі характеристики біокаталізаторів роблять їх використання у ряді випадків неприйнятним. Наприклад, більшість ферментів розпадається у разі підвищення температури. Вчені намагаються подолати подібні перешкоди та збільшити стабільність ферментів у суворих умовах виробництва за допомогою методів білкової інженерії.
Крім промислового застосування, білкова інженерія знайшла собі гідне місце у медичних розробках. Дослідники синтезують білки, здатні зв'язуватися з вірусами та мутантними генами, що викликають пухлини, та знешкоджувати їх; створюють високоефективні вакцини та вивчають білки-рецептори клітинної поверхні, які часто є мішенями для фармацевтичних препаратів. Вчені, які займаються вдосконаленням продуктів харчування, використовують білкову інженерію для покращення якостей білків, що забезпечують збереження продуктів рослинного походження, а також желюючих речовин або загусників.
Ще однією сферою застосування білкової інженерії є створення білків, здатних нейтралізувати речовини та мікроорганізми, які можуть бути використані для хімічних та біологічних атак. Наприклад, ферменти гідролази здатні знешкоджувати як нервово-паралітичні гази, так і пестициди, що використовуються в сільському господарстві. При цьому виробництво, зберігання та використання ферментів не є небезпечним для навколишнього середовища та здоров'я людей.
білок інженерія модифікований мутагенез
Список літератури
1.Білкова інженерія.
2.Білкова інженерія. Загадки генетики. / В'ячеслав Маркін // Таємниці, загадки, факти.
Білкова інженерія. //Велика Російська енциклопедія.
Білкова інженерія. // Довідник хіміка 21.
Білкова інженерія та ефективність ліків.
Білкова інженерія. / А.І. Корнелюк//Biopolymers and Cell.
Білкова інженерія підвищить ефективність ліків. // Популярна механіка.
Білкова інженерія. Одержання інсуліну. // Біофайл – науково-інформаційний журнал.
Біотехнологія. Основні напрямки та досягнення. // Біологія для абітурієнтів та вчителів.
Богданов А.А., Медніков Б.М. Влада над геном/А. А. Богданов, Б.М. Медніков - М.: Просвітництво, 1989 - с.208
Генна інженерія. // Здоров'я.
Гени та хіміки. // Генетика.
13. Глік Б., Пастернак Дж. Молекулярна біотехнологія. Принципи та застосування / Б. Глік, Дж. Пастернак. - М: Світ, 2002.
14.Інші галузі застосування генної інженерії. / Л.В. Тимощенка, М.В. Чубик // Медицина - новини та технології.
15. Єгорова Т.А., Клунова С.М., Живухін Є.А. Основи біотехнології. / Т.А. Єгорова, С.М. Клунова, Є.А. Живухін – М., 2003.
16. Інженерія білка. // Хімія та біотехнологія.
17. Патрушев Л.І. Експресія генів/Л.І. Патрушев – М.: Наука, 2000. – 496с.
Патрушев Л.І. Штучні генетичні системи. Т. 1: Генна та білкова інженерія. / Л.І. Патрушев – М.: Наука, 2004. – 526 с.
Рибчин В.М. Основи генетичної інженерії: Підручник для вузів/В.М. Рибчин - СПб.: Вид-во СПбДТУ, 2002. - 522 с.
Степанов В.М. Молекулярна біологія Структури та функції білків. / В.М. Степанов – М.: Вища Школа, 1996.
Технології біотехнології: білкова інженерія, нанобіотехнологія, біосенсори та біочіпи. / Євгенія Рябцева // «Комерційна біотехнологія» – інтернет-журнал.
Чернавський Д.С., Чернавська Н.М. Білок-машина. Біологічні макромолекулярні конструкції. / Д.С. Чернавський, Н. М. Чернавська - М: Вид-во МДУ, 1999.
Шульц Г.Є., Ширмер Р.Х. Принципи структурної організації білків. / Г.Є. Шульц, Р.Х. Ширмер – М.: Світ, 1982.
24. Brannigan J.А., Wilkinson А.J. Protein engineering 20 years on // Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2002. Vol. 3. № 12;
25.Protein engineering. // Wikipedia, free encyclopedia.