Вторинні посередники (месенджери). Біохімічна роль вторинних месенджерів у метаболізмі Основні медіатори вегетативної нервової системи
Подробиці
Вторинні месенджери - це посередники, які здійснюють передачу сигналу з клітинної мембрани в ядро. Це необхідно для запуску процесів, що забезпечують ефект та реакцію на сигнал.
Розглянемо механізми реалізації сигналу ефекторних клітинах вісцеральних органів при активації рецепторів вегетативної нервової системи.
1. Порівняльна анатомічна характеристика ефекторної ланки вегетативної нервової та рухової систем.
2. Основні медіатори вегетативної нервової системи.
3. Основні рецептори вегетативної нервової системи.
Рецептори вегетативної нервової системи відносяться до двох суперсімейств мембранних рецепторів:
- Сімейство рецепторів, пов'язаних з іонним каналом - канал-сполучені рецептори (Nn-холінорецептор).
- G-зв'язані трансмембранні рецептори або метаботропні рецептори, активація яких призводить до утворення внутрішньоклітинного вторинного посередника, що запускає каскадні реакції, що призводять до зміни метаболізму ефекторної клітини та активації або інгібування іонних каналів (М-холінорецептори, альфа-і-бета-адрено).
Система мембранно-рецепторної взаємодії є двокомпонентною:
- Активація рецепторів шляхом взаємодії фізіологічно активної речовини з рецептором.
- Утворення чи входження внутрішньоклітинних посередників (вторинних месенджерів), які повністю чи значною мірою відтворюють ефекти фізіологічно активних речовин з допомогою каскадних реакцій.
Внутрішньоклітинні посередники (вторинні месенджери), що опосередковують активацію адренергічних та холінергічних рецепторів на ефекторних клітинах вісцеральних органів:
- циклічна аденозинмонофосфорна каслота (цАМФ, cAMP)
- циклічна гуанозинмонофосфорна кислота (цГМФ, cGMP)
- інозитолтрифосфат (IP3)
- діацилгліцерол (DAG)
- іон Са
4. Схематичне зображення Nn холінорецептора та механізм його роботи.
Шлях передачі сигналу --> Активація аденілатциклази Gs
cAMP-залежна протеїнкіназа (PKA)
цАМФ зв'язується з регуляторною субодиницею PKA, змінюється її конформація, це викликає дисоціацію і відчеплення від неї каталітичної субодиниці--> протеїнкіназу А активується.
Для від'єднання каталітичної субодиниці потрібно більше 2 молекул цАМФ
PKA - відноситься до класу Ser/Thr-кіназ, є субстрат-специфічною, може запускати каскад фосфорилювання білків (він піддається регуляції).
5. Основні класи G білків ссавців.
6. Ефекти активації бета1- та бета2-адренорецепторів у кардіоміоцитах.
7. Роль різних типів АКАР у внутрішньоклітинній локалізації протеїнкінази А та інших молекул.
Загальні уявлення про шляхи сигнальної трансдукції
Більшість регуляторних молекул між їх зв'язуванням з мембранним рецептором і остаточної реакцією клітини, тобто. зміною її роботи, вклинюються складні серії подій – певні шляхи передачі сигналу, інакше звані шляхами сигнальної трансдукції.
Регуляторні речовини прийнято поділяти на ендокринні, нейрокринні та паракринні. Ендокриннірегулятори (Гормони)виділяються ендокринними клітинами в кров і переносяться нею до клітин-мішеней, які можуть бути в будь-якому місці організму. Нейрокриннірегулятори виділяються нейронами у безпосередній близькості від клітин-мішеней. Паракринніречовини звільняються трохи далі від мішеней, але все ж таки досить близько до них, щоб досягти рецепторів. Паракринні речовини секретуються одним типом клітин, а діють на інший, проте в деяких випадках регулятори призначені тим клітинам, які їх виділили, або сусіднім клітинам, що належать до того ж типу. Це називається аутокринноїрегуляцією.
У ряді випадків останній етап сигнальної трансдукції полягає у фосфорилюванні певних ефекторних білків, що веде до посилення або пригнічення їхньої активності, а це, у свою чергу, визначає необхідну організму клітинну реакцію. Фосфорилювання білків здійснюють протеїнкінази,а дефосфорилювання - протеїнфосфатази.
Зміни протеїнкіназної активності відбуваються внаслідок зв'язування регуляторної молекули (загалом званої лігандом)з її мембранним рецептором, що запускає каскади подій, деякі з яких наведені малюнку (рис. 2-1). Активність різних протеїнкіназ регулюється рецептором не прямо, а через вторинні месенджери(вторинні посередники), у ролі яких виступають, наприклад, циклічний АМФ (цAMФ), циклічний ГМФ (цГMФ), Са 2+ , інозитол-1,4,5-трифосфат (IP 3)і діацилгліцерол (DAG).При цьому зв'язування ліганду з мембранним рецептором змінює внутрішньоклітинний рівень вторинного месенджера, що, своєю чергою, відбивається на активності протеїнкінази. Багато регулятор-
ні молекули впливають на клітинні процеси через шляхи сигнальної трансдукції за участю гетеротримерних ГТФ-зв'язувальних білків (гетеротримерних G-білків)або мономерних ГТФ-зв'язуючих білків (мономірних G-білків).
Коли молекули ліганду зв'язуються з мембранними рецепторами, що взаємодіють із гетеротримерними G-білками, відбувається перехід G-білка в активний стан шляхом зв'язування з ГТФ. Активований G-білок може потім взаємодіяти з багатьма ефекторними білками,насамперед ферментами, такими, як аденілатциклаза, фосфодіестераза, фосфоліпази С, А 2і D.Ця взаємодія запускає ланцюги реакцій (рис. 2-1), які закінчуються активацією різних протеїнкіназ, таких як протеїнкіназа А (ПКА), протеїнкіназа G (ПKG), протеїнкіназа C (ПІС).
Загалом шляхи сигнальної трансдукції за участю G-білків - протеїнкіназ включає наступні етапи.
1.Ліганд зв'язується з рецептором на мембрані клітини.
2.Пов'язаний з лігандом рецептор, взаємодіючи з G-білком, активує його, та активований G-білок пов'язує ГТФ.
3. Активований G-білок взаємодіє з одним або декількома наступними сполуками: аденілатциклазою, фосфодіестеразою, фосфоліпазами С, А 2 , D, активуючи або інгібуючи їх.
4.Внутрішньоклітинний рівень одного або декількох вторинних месенджерів, таких як цАМФ, цГМФ, Са 2+ , IP 3 або DAG, зростає або знижується.
5.Збільшення або зменшення концентрації вторинного месенджера впливає на активність однієї або декількох залежних від нього протеїнкіназ, таких як цАМФ-залежна протеїнкіназа (протеїнкіназа А), цГМФ-залежна протеїнкіназа (ПКG), кальмодулінзалежна протеїнкіназа(КМПК), протеїнкіназа С. Зміна концентрації вторинного месенджера може активувати той чи інший іонний канал.
6. Рівень фосфорилювання ферменту або іонного каналу змінюється, що впливає на активність іонного каналу, зумовлюючи кінцеву відповідь клітини.
Мал. 2-1. Деякі каскади подій, що реалізуються у клітині завдяки вторинним посередникам.
Позначення: * - активований фермент
Мембранні рецептори, пов'язані з G-білками
Мембранні рецептори, що опосередковують агоніст-залежну активацію G-білків, становлять особливе сімейство білків, в якому 500 з лишком представників. До нього відносяться α- та β-адренергічні, мускаринові ацетилхолінові, серотонінові, аденозинові, нюхові рецептори, родопсин, а також рецептори більшості пептидних гормонів. Представники сімейства рецепторів, пов'язаних з G-білками, мають сім трансмембранних α-спіралей (рис. 2-2 А), кожна з яких містить 22-28 переважно гідрофобних амінокислотних залишків.
Для деяких лігандів, наприклад, ацетилхоліну, адреналіну, норадреналіну та серотоніну, відомі різні підтипи, пов'язані з G-білками рецепторів. Найчастіше вони різняться спорідненістю до конкурентних агоністів та антагоністів.
Далі представлена (рис. 2-2 Б) молекулярна організація аденілатциклази - ферменту, що продукує цАМФ (перший відкритий вторинний месенджер). Регуляторний шлях аденілатциклази вважається класичним шляхом сигнальної трансдукції, яка обумовлена G-білками.
Аденілатциклаза є основою позитивного або негативного контролю шляхів сигнальної трансдукції через G-білки. При позитивному контролі зв'язування стимулюючого ліганду, наприклад, адреналіну, що діє через β-адренергічні рецептори, веде до активації гетеротримерних G-білків з α-субодиницею типу as («s» означає стимуляцію). Активація Gs-типу G-білків за допомогою пов'язаного з лігандом рецептора призводить до того, що його as-субодиниця зв'язує ГТФ, а потім дисоціює від βγ-димеру.
На малюнку 2-2 показано, як фосфоліпаза С розщеплює фосфатидилінозитол-4,5-дифосфат на інозитол-1,4,5-трифосфат і діацилгліцерол. Обидві речовини, інозитол-1,4,5-трифосфат та діацилгліцерол, відносяться до вторинних месенджерів. IP3, зв'язуючись зі специфічними лигандзависимыми Са 2+ -каналами ендоплазматичного ретикулуму, вивільняє із нього Са 2+ , тобто. підвищує концентрацію Са 2+ у цитозолі. Діацилгліцерол разом із Са 2+ активує інший важливий клас протеїнкіназ - протеїнкіназу С.
Потім показано структуру деяких вторинних месенджерів (рис. 2-2 Г-Е): цАМФ, ГМФ,
цГМФ.
Мал. 2-2. Приклади молекулярної організації деяких структур, що у шляхах сигнальної трансдукции.
А – рецептор мембрани клітини, що зв'язує на зовнішній поверхні ліганд, а всередині – гетеротримерний G-білок. Б – молекулярна організація аденілатциклази. В - структура фосфатидилінозі-тол-4,5-дифосфату та утворених під дією фосфоліпази С інозитол-1,4,5-трифосфату та діацилгліцеролу. Г - структура 3",5"-циклічного АМФ (активатора протеїнкінази А). Д – структура ГМФ. Е - структура 3",5"-циклічного ГМФ (активатора протеїнкінази G)
Гетеротрімерні G-білки
Гетеротримерний G-білок складається з трьох субодиниць: α (40 000-45 000 Так), β (близько 37 000 Так) та γ (8000-10 000 Так). Зараз відомо близько 20 різних генів, що кодують ці субодиниці, у тому числі не менше чотирьох генів β-субодиниць і приблизно сім генів γ-субодиниць ссавців. Функція та специфічність G-білка зазвичай, хоч і не завжди, визначаються його α-субодиницею. Більшість G-білків субодиниці β і γ щільно пов'язані між собою. Деякі гетеротримерні G-білки та шляхи трансдукції, в яких вони задіяні, перераховані в табл. 2-1.
Гетеротримерні G-білки є посередниками між рецепторами плазматичної мембрани для понад 100 позаклітинних регуляторних речовин та внутрішньоклітинними процесами, які вони контролюють. Загалом зв'язування регуляторної речовини з його рецептором активує G-білок, а той або активує, або інгібує фермент та/або викликає ланцюг подій, що призводять до активації певних іонних каналів.
На рис. 2-3 представлений загальний принцип роботи гетеротримерних G-білків. У більшості G-білків α-субодиниця є «робочим елементом» гетеротримерних G-білків. Активація більшості G-білків призводить до конформаційної зміни цієї субодиниці. Неактивні G-білки існують головним чином у формі αβγ-гетеротримерів,
з ГДФ у позиціях, що пов'язують нуклеотид. Взаємодія гетеротримерних G-білків з рецептором, що приєднав ліганд, веде до перетворення α-субодиниці в активну форму з підвищеною спорідненістю до ГТФ і зниженою афінністю його до βγ-комплексу. В результаті активована α-субодиниця звільняє ГДФ, приєднує ГТФ, а потім дисоціює від βγ-димеру. У більшості G-білків дисоційована α-субодиниця потім взаємодіє з ефекторними білками в дорозі сигнальної трансдукції. Однак у деяких G-білків βγ-димер, що звільнився, може бути відповідальним за всі або деякі ефекти рецептор-лігандного комплексу.
p align="justify"> Робота деяких іонних каналів модулюється G-білками безпосередньо, тобто. без вторинних месенджерів. Наприклад, зв'язування ацетилхоліну з мускариновими М2-рецепторами серця та деяких нейронів веде до активації особливого класу К+-каналів. У цьому випадку зв'язування ацетилхоліну з рецептором мускарину веде до активації G-білка. Його активована α-субодиниця потім відокремлюється від βγ-димеру, а βγ-димер безпосередньо взаємодіє з особливим класом К + -каналів, наводячи їх у відкритий стан. Зв'язування ацетилхоліну з мускариновими рецепторами, що підвищує К+-провідність пейсмекерних клітин у синоатріальному вузлі серця - один із головних механізмів, за допомогою якого парасимпатичні нерви викликають зменшення частоти серцевих скорочень.
Мал. 2-3. Принцип роботи гетеротримерних ГТФ-зв'язувальних білків (гетеротримерних G-білків).
Таблиця 2-1.Деякі гетеротримерні ГТФ-зв'язуючі білки ссавців, класифіковані на основі їх α-субодиниць *
* У кожному класі α-субодиниць розрізняють кілька ізоформ. Ідентифіковано понад 20 α-субодиниць.
Мономірні G-білки
Клітини містять ще одне сімейство ГТФзв'язуючих білків, які називають мономірнимиГТФ-зв'язуючими білками. Вони також відомі як G-білки з низькою молекулярною масоюабо малі G-білки(Молекулярна маса 20 000-35 000 Так). У таблиці 2-2 перераховані основні підкласи мономерних ГТФзв'язуючих білків та деякі з їх властивостей. Ras-подібні та Rho-подібні мономерні ГТФ-зв'язуючі білки беруть участь у шляху сигнальної трансдукції на етапі передачі сигналу від тирозинкінази, рецептора фактора росту, на внутрішньоклітинні ефектори. Серед процесів, регульованих шляхами сигнальної трансдукції, до яких залучені мономерні ГТФзв'язуючі білки, можна назвати елонгацію поліпептидного ланцюга в ході білкового синтезу, проліферацію та диференціювання клітин, їх злоякісне переродження, контроль актинового цитоскелета, зв'язок між цитоске
та позаклітинним матриксом, транспорт везикул між різними органелами та екзоцитозну секрецію.
Мономірні ГТФ-зв'язуючі білки, як і їх гетеротримерні аналоги, являють собою молекулярні перемикачі, що існують у двох формах - активованою "включеною" та інактивованою "вимкненою" (рис. 2-4 Б). Однак активація та інактивація мономерних ГТФ-зв'язувальних білків потребує додаткових регуляторних білків, які, наскільки відомо, не потрібні для роботи гетеротримерних G-білків. Мономірні G-білки активуються гуанін-нуклеотид-звільняючими білками,а інактивуються ГТФаза-активуючими білками.Таким чином, активація та інактивація мономерних ГТФ-зв'язувальних білків контролюється сигналами, які змінюють активність гуанін-нуклеотид-звільняючих білківабо ГТФаза-активуючих білківшвидше, ніж шляхом прямого на мономерні G-білки.
Мал. 2-4. Принцип роботи мономерних ГТФ-білків, що зв'язують (мономірних G-білків).
Таблиця 2-2.Підродини мономерних ГТФ-зв'язувальних білків та деякі регульовані ними внутрішньоклітинні процеси
Механізм роботи гетеротримерних G-білків
Неактивні G-білки існують головним чином у формі αβγ-гетеротримерів, з ГДФ у їхніх позиціях, що зв'язують нуклеотид (рис. 2-5 А). Взаємодія гетеротримерних G-білків з рецептором, що приєднав ліганд, веде до перетворення α-субодиниці в активну форму, яка має підвищену спорідненість до ГТФ і знижену афінність його до βγ-комплексу (рис. 2-5 Б). У більшості гетеротримерних G-білків саме α-субодиниця є структурою, яка передає інформацію. Активація більшості G-білків призводить до конформаційної зміни α-субодиниці.
В результаті активована α-субодиниця звільняє ГДФ, приєднує ГТФ (рис. 2-5 В), а потім дисоціює від β-димера (рис. 2-5 Г). У більшості G-білків дисоційована α-субодиниця відразу взаємодіє з ефекторними білками (Е 1) у дорозі сигнальної трансдукції (рис. 2-5 Г). Однак у деяких G-білків βγ-димер, що звільнився, може бути відповідальним за всі або за деякі ефекти рецептор-лігандного комплексу. Потім β-димер взаємодіє з ефекторним білком Е 2 (рис. 2-5 Д). Далі показано, що члени RGS сім'ї G-білка стимулюють гідроліз ГТФ (рис. 2-5). Це інактивує α-субодиницю і поєднує всі субодиниці в αβγ-гетеротример.
Мал. 2-5. Цикл роботи гетеротримерного G-білка, що запускає подальший ланцюг подій за допомогою своєїα -субодиниці.
Позначення: R – рецептор, L – ліганд, Е – ефекторний білок
Шляхи сигнальної трансдукції через гетеротримерні G-білки
На малюнку 2-6 А показані три ліганди, їх рецептори, пов'язані з різними G-білками, та їх молекулярні мішені. Аденілатциклаза є основою для позитивного або негативного контролю шляхів сигнальної трансдукції, які обумовлені G-білками. При позитивному контролі зв'язування стимулюючого ліганду, наприклад, норадреналіну, що діє через β-адренергічні рецептори, веде до активації гетеротримерних G-білків з α-субодиницею типу αS («s» означає стимуляцію). Тому такий G-білок називають G-білком G S-типу. Активація G s -типу G-білків за допомогою пов'язаного з лігандом рецептора призводить до того, що його s - субодиниця зв'язує ГТФ і потім дисоціює від βγ-димера.
Інші регуляторні речовини, такі як адреналін, що діє через α 2 -рецептори, або аденозин, що діє через α 1 -рецептори, або дофамін, що діє через D 2 -рецептори, беруть участь у негативному або інгібуючому контролі аденілатциклази. Ці регуляторні речовини активують G i-тип G-білків, які мають α-субодиницю типу α i («i» означає інгібування). Зв'язування інгібуючого ліганду з його
рецептором активує G i-тип G-білків і викликає дисоціацію його αi-субодиниці від βγ-димеру. Активована αi-субодиниця зв'язується з аденілатциклазою і пригнічує її активність. Крім того, βγ-димери можуть пов'язувати вільні αs-субодиниці. Цим шляхом зв'язування βγ-димерів із вільною α s -субодиницею додатково пригнічує стимуляцію аденілатциклази, блокуючи дію стимулюючих лігандів.
Ще один клас позаклітинних агоністів (рис. 2-6 А) зв'язується з рецепторами, які активують за допомогою G-білка, званого G q , β-ізоформу фосфоліпази С. Вона розщеплює фосфатидилінозитол-4,5-дифосфат (фосфоліпід, у малих кількостях присутній у плазматичній мембрані) на інозитол-1,4,5-трифосфат та діацилгліцерол, які відносяться до вторинних месенджерів. IP 3 зв'язуючись зі специфічними лигандзависимыми Са 2+ -каналами ендоплазматичного ретикулуму, вивільняє з нього Са 2+ , тобто. підвищує концентрацію Са 2+ у цитозолі. Са 2+ -канали ендоплазматичного ретикулуму залучені в електромеханічне сполучення в скелетному та серцевому м'язі. Діацилгліцерол разом із Са 2+ активує протеїнкіназу С. До її субстратів відносяться, наприклад, білки, що беруть участь у регуляції клітинного поділу.
Мал. 2-6. Приклади шляхів трансдукції сигнальної через гетеротримерні G-білки.
А - у трьох наведених прикладах зв'язування нейротрансмітера з рецептором веде до активації G-білка та подальшого включення шляхів вторинних месенджерів. G s , G q і G i мають на увазі три різних типу гетеротримерних G-білків. Б - регуляція клітинних білків фосфорилюванням веде до посилення чи гноблення їхньої активності, але це, своєю чергою, визначає необхідну організму клітинну реакцію. Фосфорилювання білків здійснюють протеїнкінази, а дефосфорилювання - протеїнфосфатази. Протеїнкіназа переносить фосфатну групу (Pi) від АТФ на серинові, треонінові або тирозинові залишки білків. Це фосфорилювання оборотно змінює структуру та функції клітинних білків. Обидва типи ферментів - кінази та фосфатази - регулюються різними внутрішньоклітинними вторинними месенджерами
Шляхи активації внутрішньоклітинних протеїнкіназ
Взаємодія гетеротримерних G-білків з рецептором, що приєднав ліганд, веде до перетворення α-субодиниці в активну форму, яка має підвищену спорідненість до ГТФ і знижену афінність його до βγ-комплексу. Активація більшості G-білків призводить до конформаційної зміни α-субодиниці, яка звільняє ГДФ, приєднує ГТФ, а потім дисоціює від βγ-димеру. Далі дисоційована α-субодиниця взаємодіє з ефекторними білками в дорозі сигнальної трансдукції.
На малюнку 2-7 А продемонстрована активація гетеротримерних G-білків G s -типу з α-субодиницею типу α s , яка відбувається завдяки зв'язуванню з лігандом рецептора і призводить до того, що α s -субодиниця G-білків G s -типу пов'язує ГТФ і потім дисоціює від βγ-димеру, а далі взаємодіє з аденілатциклазою.Це призводить до підвищення рівня цАМФ та активації ПКА.
На малюнку 2-7 Б продемонстрована активація гетеротримерних G-білків G t -типу з α-субодиницею типу α t , яка відбувається завдяки зв'язуванню з лігандом рецептора і призводить до того, що α t -субодиниця G-білків G t -типу активується і потім дисоціює від βγ-димеру, а далі взаємодіє з фосфодіестеразою.Це призводить до підвищення рівня цГМФ та активації ПKG.
Рецептор катехоламінів α 1 взаємодіє з G αq -субодиницею, що активує фосфоліпазу С. На малюнку 2-7 В продемонстрована активація гетеротримерних G-білків G αq -типу з α-субодиницею типу α q , яка відбувається завдяки зв'язуванню ліганду , що α q -субодиниця G-білків G αq -типу активується і потім дисоціює від βγ-димеру, а далі взаємодіє з фосфоліпазою С.Вона розщеплює фосфатидилінозитол-4,5-дифосфат на IP 3 і DAG. Це призводить до підвищення рівня IP 3 та DAG. IP 3 зв'язуючись зі специфічними лигандзависимыми Са 2+ - каналами ендоплазматичного ретикулуму,
вивільняє з нього Са 2+. DAG викликає активацію протеїнкінази С. У нестимульованій клітині значна кількість цього ферменту знаходиться в цитозолі в неактивній формі. Са 2+ змушує протеїнкіназу зв'язуватися з внутрішньою поверхнею плазматичної мембрани. Тут фермент може активуватися діацилгліцеролом, який утворюється при гідролізі фосфатидилінозитол-4,5-дифосфату. Мембранний фосфатидилсерин також може бути активатором протеїнкінази, якщо фермент знаходиться в мембрані.
Описано близько 10 ізоформ протеїнкінази С. Хоча деякі з них присутні у багатьох клітинах ссавців, проте підтипи γ і ε виявлені, головним чином, у клітинах центральної нервової системи. Підтипи протеїнкінази С розрізняються не тільки розподілом по організму, але, мабуть, механізмами регуляції своєї активності. Деякі їх у нестимульованих клітинах пов'язані з плазматичної мембраною, тобто. не вимагають активації збільшення концентрації Са 2+ . Деякі ізоформи протеїнкінази С активуються арахідоновою кислотою або іншими ненасиченими жирними кислотами.
Початкова короткочасна активація протеїнкінази відбувається під дією діацилгліцеролу, який звільняється, коли фосфоліпаза С β активується, а також під впливом Са 2+ , звільненого з внутрішньоклітинних сховищ за допомогою IP 3 . Довготривала активація протеїнкінази С запускається рецептор-залежними фосфоліпазами А 2 і D. Вони діють первинно на фосфатидилхолін - основний мембранний фосфоліпід. Фосфоліпаза А 2 відокремлює від нього жирну кислоту у другому положенні (зазвичай ненасичену) та лізофосфатидилхолін. Обидва ці продукти активують певні ізоформи протеїнкінази С. Рецептор-залежна фосфоліпаза D розщеплює фосфатидилхолін таким чином, що утворюється фосфатидна кислота та холін. Фосфатидна кислота далі розщеплюється до діацилгліцеролу, що бере участь у тривалій стимуляції протеїнкінази С.
Мал. 2-7. Основні принципи активації протеїнкінази А, протеїнкінази G та протеїнкінази С.
Позначення: R – рецептор, L – ліганд
цAMФ-залежна протеїнкіназа (протеїнкіназа А) та пов'язані з нею сигнальні шляхи
У відсутності цАМФ, цАМФ-залежна протеїнкіназа (протеїнкіназа А) складаються з чотирьох субодиниць: двох регуляторних та двох каталітичних. У більшості типів клітин каталітична субодиниця одна й та сама, а регуляторні субодиниці високоспецифічні. Присутність регуляторних субодиниць майже повністю пригнічує ферментативну активність комплексу. Таким чином, активація ферментативної активності цАМФ-залежної протеїнкінази повинна залучати відділення регуляторних субодиниць від комплексу.
Активація відбувається у присутності мікромолярних концентрацій цАМФ. Кожна регуляторна субодиниця пов'язує дві молекули. Зв'язування цАМФ індукує конформаційні зміни в регуляторних субодиницях та знижує афінність їхньої взаємодії з каталітичними субодиницями. В результаті цього регуляторні субодиниці відокремлюються від каталітичних, і каталітичні субодиниці стають активованими. Активна каталітична субодиниця фосфорилює білкимішені за певними сериновими та треоніновими залишками.
Порівняння амінокислотних послідовностей цАМФ-залежної та інших класів протеїнкіназ показує, що, незважаючи на сильні відмінності в їх регуляторних властивостях, всі ці ферменти високогомологічні за первинною структурою серединної частини. Ця частина містить домен АТФ-зв'язуючий і активний центр ферменту, що забезпечує перенесення фосфату з АТФ на білок-акцептор. Ділянки кіназ поза цієї каталітичної серединної частини білка беруть участь у регуляції кіназної активності.
Визначено також кристалічну структуру каталітичної субодиниці цАМФ-залежної протеїнкінази. Каталітична середня частина молекули, що є у всіх відомих протеїнкіназ, складається з двох часток. Найменша містить незвичайний АТФ-зв'язуючий ділянку, а велика частка містить ділянку зв'язування пептиду. Багато протеїнкінази містять також регуляторну ділянку, відому як псевдосубстратний домен.За амінокислотною послідовністю він нагадує фосфориловані ділянки субстратних білків. Псевдосубстратний домен, зв'язуючись з активним центром протеїнкінази, пригнічує фосфорилювання справжніх субстратів протеїнкінази. Активація кінази може включати фосфорилювання або нековалентну алостеричну модифікацію протеїнкінази для усунення інгібуючої дії псевдосубстратного домену.
Мал. 2-8. цAMФ-залежна протеїнкіназа А та мішені.
Коли адреналін зв'язується з відповідним рецептором, активація s-субодиниці стимулює аденілатциклазу зі збільшенням рівня цАМФ. цАМФ активує протеїнкіназу А, яка шляхом фосфорилювання дає три основні ефекти. (1) Протеїнкіназа А активує кіназу фосфорилази глікогену, яка фосфорилює та активує фосфорилазу глікогену. (2) Протеїнкіназа А інактивує глікогенсинтазу і таким чином зменшує утворення глікогену. (3) Протеїнкіназа А активує інгібітор фосфопротеїн-фосфатази-1 і тим самим інгібує фосфатазу. Ефект загалом полягає у координації змін рівня глюкози.
Позначення: УДФ-глюкоза - урідіндифосфатглюкоза
Гормональне регулювання активності аденілатциклази
На малюнку 2-9 А представлений важливий механізм індукованої гормонами стимуляції та інгібування аденілатциклази. Взаємодія ліганду з рецептором, пов'язаним з α-субодиницею типу α s (стимулююча), викликає активацію аденілатциклази, тоді як взаємодія ліганду з рецептором), пов'язаним з α-субодиницею типу α i (інгібуюча), викликає інгібування ферменту. G βγ -субодиниця і в стимулюючих, і в інгібуючих G-білках ідентична. Gα-субодиниці та рецептори різні. Ліганд-стимульоване утворення активних Gα ГТФ комплексів відбувається за допомогою однакових механізмів в обох Gαs,- і Gαi-протеїнах. Однак G αs ГТФ і G αi ГТФ по-різному взаємодіють з аденілатциклазою. Одна (G αs ГТФ) стимулює, а інша (G αi ГТФ) інгібує її каталітичну активність.
На малюнку 2-9 Б представлений механізм індукованої певними гормонами активації та інгібування аденілатциклази. β 1 -, β 2 - і D 1 -рецептори взаємодіють із субодиницями, які активують аденілатциклазу та підвищують рівень цАМФ. α 2 -і D 2 -рецептори взаємодіють з G αi субодиницями, які інгібують аденілатциклазу. (Що стосується α 1 -рецептора, то він взаємодіє з G -субодиницею, яка активує фосфоліпазу С.) Розглянемо один із прикладів, представлених на малюнку. Адреналін зв'язується з β 1 -рецептором, що призводить до активації G αs -білка, який стимулює аденілатциклазу. Це призводить до збільшення внутрішньоклітинного рівня цАМФ, і таким чином посилює активність ПКА. З іншого боку, норадреналін зв'язується з α 2 -рецептором, що призводить до активації G αi -білка, який пригнічує аденілатциклазу і тим самим знижує внутрішньоклітинний рівень цАМФ, зменшуючи активність ПКА.
Мал. 2-9. Індукована лігандами (гормонами) активація та інгібування аденілатциклази.
А – важливий механізм. Б - механізм стосовно конкретних гормонів
Протеїнкіназа С та пов'язані з нею сигнальні шляхи
Рецептор ? IP 3 , зв'язуючись зі специфічними ліганд-залежними Са 2+ -каналами ендоплазматичного ретикулуму, вивільняє з нього Са 2+, тобто. підвищує концентрацію Са 2+ у цитозолі. DAG викликає активацію протеїнкінази С. У нестимульованій клітині цей фермент знаходиться в цитозолі в неактивній
формі. Якщо цитозольний рівень Са 2+ підвищується, відбувається взаємодія Са 2+ з протеїнкіназою, що призводить до зв'язування протеїнкінази З з внутрішньою поверхнею клітинної мембрани. У такому положенні фермент активується діацилгліцеролом, що утворюється при гідролізі фосфатидилінозитол-4,5-дифосфату. Мембранний фосфатидилсерин також може бути активатором протеїнкінази, якщо фермент знаходиться в мембрані.
У таблиці 2-3 наведено ізоформи протеїнкінази С ссавців та властивості цих ізоформ.
Таблиця 2-3.Властивості ізоформ протеїнкінази З ссавців
ДАГ – діацилгліцерол; ФС – фосфатидилсерин; ФФА - цис-ненасичені жирні кислоти; ЛФХ – лізофосфатидилхолін.
Мал. 2-10. Сигнальні шляхи діацилгліцерол/інозитол-1,4,5-трифосфат
Фосфоліпази та пов'язані з ними сигнальні шляхи на прикладі арахідонової кислоти
Деякі агоністи за допомогою G-білків активують фосфоліпазу А 2 ,яка діє мембранні фосфоліпіди. Продукти їх реакцій можуть активувати протеїнкіназу С. Зокрема, фосфоліпаза A 2 відокремлює від фосфоліпідів жирну кислоту, що знаходиться в другому положенні. Внаслідок того, що деякі фосфоліпіди містять у цьому положенні арахідонову кислоту, викликане фосфоліпазою A 2 , розщеплення цих фосфоліпідів звільняє значну її кількість.
Вищеописаний сигнальний шлях арахідонової кислоти, пов'язаний з фосфоліпазою А 2 називають прямим. Непрямий шлях активації арахідонової кислоти пов'язаний з фосфоліпазою β.
Арахидонова кислота сама по собі є ефекторною молекулою, а крім того, служить попередником для внутрішньоклітинного синтезу простагландинів, простациклінів, тромбоксаніві лейкотрієнів– важливих класів регуляторних молекул. Арахидонова кислота також утворюється з продуктів розщеплення діацил-гліцеролів.
Простагландини, простацикліни та тромбоксани синтезуються з арахідонової кислоти. циклооксигеназно-залежним шляхом,а лейкотрієни - ліпоксигеназно-залежним шляхом.Один із протизапальних ефектів глюкокортикоїдів полягає саме в інгібуванні фосфоліпази A 2 , яка звільняє арахідонову кислоту з фосфоліпідів. Ацетилсаліцилова кислота (аспірин ) та інші нестероїдні протизапальні засоби пригнічують окислення арахідонової кислоти циклооксигеназою.
Мал. 2-11. Сигнальні шляхи арахідонової кислоти.
Позначення: ПГ - простагландин, ЛГ - лейкотрієн, ГПЕТЕ - гідропероксіейкозатетраєноат, ГЕТЕ - гідроксійкозатетраєноат, ЕПР - ендоплазматичний ретикулум
Кальмодулін: будова та функції
Безліч життєво важливих клітинних процесів, включаючи звільнення нейротрансмітерів, секрецію гормонів та м'язове скорочення, регулюється цитозольним рівнем Са2+. Один із шляхів впливу цього іона на клітинні процеси полягає в його зв'язуванні з кальмодуліном.
Кальмодулін- Білок з молекулярною вагою 16700 (рис. 2-12 А). Він присутній у всіх клітинах, іноді становлячи до 1% їхнього загального білкового вмісту. Кальмодулін пов'язує чотири іони кальцію (рис. 2-12 Б і В), після чого цей комплекс регулює активність різних внутрішньоклітинних білків, багато з яких не відносяться до протеїнкіназ.
Комплекс Са 2+ з кальмодуліном активує також кальмодулін-залежні протеїнкінази. Специфічний кальмодулін-залежні протеїнкінази фосфорилюють специфічні ефекторні білки, наприклад, регуляторні легкі ланцюги міозину, фосфорилазу та фактор елонгації II. Мультифункціональні кальмодулін-залежні протеїнкінази фосфорилують численні білки ядра, цитоскелета або мембранні білки. Деякі кальмодулінзалежні протеїнкінази, такі, як кіназа
легкого міозинового ланцюга та кіназу фосфорилази діють тільки на один клітинний субстрат, тоді як інші поліфункціональні та фосфорилують більш ніж один субстратний білок.
Кальмодулін-залежна протеїнкіназа II відноситься до мажорних білків нервової системи. У деяких галузях мозку на неї припадає до 2% загального білка. Ця кіназа бере участь у механізмі, при якому збільшення концентрації Са 2+ у нервовому закінченні викликає звільнення нейротрансмітера за типом екзоцитозу. Її головним субстратом служить білок під назвою синапсин I,присутній у нервових закінченнях і зв'язується із зовнішньою поверхнею синаптичних везикул. Коли синапсин I пов'язаний із везикулами, він запобігає екзоцитозу. Фосфорилювання синапсину I викликає його відокремлення від везикул, дозволяючи їм викинути нейротрансмітер в синаптичну щілину шляхом екзоцитозу.
Кіназа легких ланцюгів міозину відіграє важливу роль у регуляції скорочення гладких м'язів. Підвищення цитозольної концентрації Са2+ у клітинах гладких м'язів активує кіназу легких ланцюгів міозину. Фосфорилювання регуляторних легких ланцюгів міозину призводить до тривалого скорочення гладких клітин.
Мал. 2-12. Кальмодулін.
А - кальмодулін без кальцію. Б - зв'язування кальцію з кальмодуліном та пептидною мішенню. В – схема зв'язування.
Позначення: EF - Са 2+ -зв'язуючі домени кальмодуліну
Рецептори із власною ферметативною активністю (каталітичні рецептори)
Гормони та фактори росту зв'язуються з протеїнами поверхні клітини, які мають ферментативну активність на цитоплазматичній стороні мембрани. На малюнку 2-13 представлено п'ять класів каталітичних рецепторів.
Один із характерних екземплярів трансмембранних рецепторів із гуанілатциклазною активністю, рецептор передсердного натрій-уретичного пептиду (ANP).Мембранний рецептор, з яким зв'язується ANP, залежить від розглянутих систем сигнальної трансдукции. Вище було описано дію позаклітинних агоністів, які, зв'язуючись з мембранними рецепторами, або активують аденілатциклазу через G s -білки, або пригнічують її через G i . Мембранні рецептори для ANP цікаві тим, що самі рецептори мають гуанілатциклазну активність, що стимулюється зв'язуванням ANP з рецептором.
ANP-рецептори мають позаклітинний ANP-зв'язуючий домен, єдину трансмембранну спіраль і внутрішньоклітинний гуанілатциклазний домен. Зв'язування ANP з рецептором підвищує внутрішньоклітинний рівень цГМФ, що стимулює цГМФ-залежну протеїнкіназу. На противагу цАМФ-залежної протеїнкінази, що має регуляторну та каталітичну субодиниці, регуляторні та каталітичні домени цГМФ-залежної протеїнкінази знаходяться на одному поліпептидному ланцюзі. цГМФзалежна кіназа потім фосфорилює внутрішньоклітинні білки, що призводить до різних клітинних відповідей.
Рецептори з серін-треонін-кіназною активністюфосфорилируют білки тільки по залишках серину та/або треоніну.
Ще одне сімейство мембранних рецепторів, не пов'язаних з G-білками, складається з білків з власної йтирозин-протеїнкіназної активністю. Рецепторами з власною тирозин-протеїнкіназною активністюслужать білки з глікозильованим позаклітинним доменом, єдиним
трансмембранною ділянкою та внутрішньоклітинним доменом з тирозин-протеїнкіназною активністю. Зв'язування з ними агоніста, наприклад фактора росту нервів (NGF),стимулює тирозин-протеїнкіназну активність, що фосфорилює специфічні білки-ефектори за певними тирозиновими залишками. Більшість рецепторів для факторів росту димеризуються, коли зв'язується з ними NGF. Саме димеризація рецептора веде до появи у нього тирозинпротеїнкіназної активності. Активовані рецептори часто фосфорилують себе, що називається аутофосфорилированием.
До надродини пептидних рецепторіввідносять рецептори інсуліну. Це також тирозин-протеїнкінази. У підкласі рецепторів, що належать до сімейства інсулінових рецепторів, нелігандний рецептор існує як дисульфід-пов'язаний димер. Взаємодія з інсуліном призводить до конформаційних змін обох мономерів, що підвищує зв'язування інсуліну, активує рецепторну тирозинкіназу та веде до збільшення аутофосфорилювання рецептора.
Зв'язування гормону або фактора росту з його рецептором запускає різноманітні клітинні відповіді, включаючи надходження в цитоплазму Са2+, збільшення Na+/H+ обміну, стимуляцію захоплення амінокислот і цукру, стимуляцію фосфоліпази Сβ та гідроліз фосфатидилінозитолдифосфату.
Рецептори гормону росту, пролактинуі еритропоетин,також як рецептори інтерферонуі багатьох цитокінів,безпосередньо не служать протеїнкіназами. Однак після активації ці рецептори утворюють сигнальні комплекси з внутрішньоклітинними тирозин-протеїнкіназами, які запускають їх внутрішньоклітинні ефекти. Саме тому вони не є справжніми рецепторами з власною тирозин-протеїнкіназною активністю, а просто зв'язуються з ними.
На основі структури можна вважати, що трансмембранні тирозин-протеїнфосфатазитакож являють собою рецептори, які з тирозин-протеинфосфатазная активність модулюється позаклітинними лігандами.
Мал. 2-13. Каталітичні рецептори.
А - рецептор гуанілциклази;
Рецептор-пов'язані тирозинпротеїнкінази на прикладі рецепторів інтерферону
Рецептори інтерферону безпосередньо не є протеїнкіназами. Після активації ці рецептори утворюють сигнальні комплекси з внутрішньоклітинними тирозин-протеїнкіназами, які запускають їх внутрішньоклітинні ефекти. Тобто вони не є істинними рецепторами з власною тирозин-протеїнкіназною активністю, а просто зв'язуються з ними. Такі рецептори називаються рецептор-пов'язаними (рецептор-залежними) тирозин-протеїнкіназами.
Механізми, завдяки яким ці рецептори діють, запускаються, коли гормон зв'язується з рецептором, що спричиняє його димеризацію. Рецепторний димер пов'язує одну або кілька членів Janus-родини тирозин-протеїнкіназ (JAK) JAK потім перехресно
фосфорилують один одного, а також рецептор. Члени сімейства перетворювачів сигналу та активаторів транскрипції (STAT) пов'язують фосфорильовані домени на комплексі рецептора та JAK. STAT-білки фосфорилюються JAK-кіназами і потім від'єднуються від сигнального комплексу. Зрештою, фосфориловані STAT-білки утворюють димери, які рухаються до ядра, щоб активувати транскрипцію певних генів.
Специфіка рецептора для кожного гормону частково залежить від специфіки членів сімейства JAK або STAT, що об'єднуються для утворення сигнального комплексу. У деяких випадках сигнальний комплекс також активує MAP-(мітоген-активуючий протеїн)-кіназний каскад за допомогою адапторних білків, що використовуються рецепторними тирозинкіназами. Деякі з відповідей рецепторних тирозинкіназних лігандів також залучають JAK та STAT шляхи.
Мал. 2-14. Приклад каталітичних рецепторів, асоційованих з тирозин-протеїнкіназною активністю. Рецептор, що активується? -інтерфероном (А) таγ -інтерфероном (Б)
Ras-подібні мономерні G-білки та опосередковані ними шляхи трансдукції
Ліганд, наприклад, фактор росту, зв'язується з рецептором, що володіє власною тирозинпротеїнкіназною активністю, що призводить до збільшення транскрипції в 10-ступінчастому процесі. Ras-подібні мономерні ГТФ-зв'язуючі білкиберуть участь у шляху сигнальної трансдукції на етапі передачі сигналу від рецепторів з власною тирозин-протеїнкіназною активністю (наприклад, рецепторів фактора росту) на внутрішньоклітинні ефектори. Активація та інактивація мономерних ГТФ-зв'язувальних білків потребують додаткових регуляторних білків. Мономірні G-білки активуються гуанін-нуклеотид-звільняючими білками (GNRP), а інактивуються ГТФаза-активуючими білками (GAP).
Мономірні ГТФ-зв'язуючі білки сімейства Ras є посередниками зв'язування мітогенних лігандів та їх тирозин-протеїнкіназних рецепторів, що запускає внутрішньоклітинні процеси, що ведуть до проліферації клітин. Коли Ras-білки є неактивними, клітини не реагують на фактори росту, що діють через тирозинкіназні рецептори.
Активація Ras запускає шлях сигнальної трансдукції, що призводить в кінцевому підсумку до транскрипції певних генів, що сприяють росту клітин. Каскад MAP-кінази (МАРК) залучається до відповіді при активації Ras. Протеїнкіназа також активує каскад MAP-кінази. Таким чином, каскад MAP-кінази виявляється важливою точкою конвергенції для різноманітних ефектів, що викликають проліферацію клітин. Більше того, тут спостерігається перехрест між протеїнкіназою С та тирозинкіназами. Наприклад, γ-ізоформа фосфоліпази С активується шляхом зв'язування з активованим Ras-білком. Ця активація передається на протеїнкіназу С у процесі стимуляції фосфоліпідного гідролізу.
На малюнку 2-15 представлений механізм, що включає 10 ступенів.
1. Зв'язування ліганду призводить до димеризації рецептора.
2. Активована тирозин-протеїнкіназа (RTK) фосфорилює себе.
3.GRB 2 (growth factor receptor-bound protein-2), SH 2 містить протеїн, дізнається фосфотирозинові залишки на активованому рецепторі.
4. Зв'язування GRB 2 включає SOS (son of sevenless)обмінний протеїн гуанінуклеотиду.
5.SOS активує Ras, формуючи на Ras ГТФ замість ГДФ.
6.Активний комплекс Ras-ГТФ активує інші протеїни фізичним включенням їх у плазматичну мембрану. Активний комплекс Ras-ГТФ взаємодіє з N-термінальною частиною серин-треонін кінази Raf-1 (відомої як мітоген-активуючий протеїн, MAP) першої серії послідовності активованих протеїнкіназ, які передають активаційний сигнал в ядро клітини.
7.Raf-1 фосфорилює та активує протеїнкіназу, названу MEK, яка відома як кіназа МАР-кінази (МАРКК). MEK - це мультифункціональна протеїнкіназа, що фосфорилює субстрати залишків тирозину та серину/треоніну.
8.MEK фосфорилює МАР-кіназу (МАРК), яка також викликається позаклітинним сигналом - регуляторною кіназою (ERK 1, ERK 2). Активація МАРК потребує подвійного фосфорилювання на сусідніх залишках серину та тирозину.
9.МАРК служить найважливішою ефекторною молекулою Ras-залежної сигнальної трансдукції, оскільки вона фосфорилює багато клітинних протеїнів після мітогенної стимуляції.
10. Активована МАРК переноситься в ядро, де вона фосфорилює фактор транскрипції. Загалом активований Ras активує МАР
шляхом зв'язування із нею. Результатом цього каскаду є фосфорилювання та активація МАР-кінази, яка у свою чергу фосфорилює фактори транскрипції, білкові субстрати та інші протеїнкінази, важливі для поділу та інших відповідей клітин. Активація Ras залежить від адаптерних білків, що зв'язуються з фосфотирозиновими доменами активованих факторами росту рецепторів. Ці адаптерні білки приєднуються та активують GNRF (гуанін-нуклеотидобмінний протеїн), який активує Ras.
Мал. 2-15. Регуляція транскрипції Ras-подібними мономерними G-білками, що запускається з рецептора з власною тирозин-протеїнкіназною активністю
Регуляція транскрипції білком, що взаємодіє з цАМФзалежним елементом ДНК (CREB)
CREB - поширений транскрипційний фактор - в нормі пов'язаний з ділянкою ДНК, названою CRE (САМР response element).За відсутності стимуляції CREB дефосфорильований і не впливає на транскрипцію. Численні шляхи сигнальної трансдукції за допомогою активації кіназ (таких, як ПКА, Са 2+ /кальмодулін-кіназа IV, МАР-кіназа) призводять до фосфорилування CREB. Фосфорильований CREB зв'язується CBP(CREB-binding protein- CREB-зв'язуючим протеїном), який має домен, що стимулює транскрипцію. Паралельно фосфорилювання активує РР1
(фосфопротеінфосфатазу 1), яка дефосфорилює CREB, що призводить до зупинки транскрипції.
Показано, що активація CREB-опосередкованого механізму є важливою для реалізації таких вищих когнітивних функцій, як навчання та пам'ять.
На малюнку 2-15 показано також будову цАМФзалежної ПКА, яка без цАМФ складається з чотирьох субодиниць: двох регуляторних і двох каталітичних. Присутність регуляторних субодиниць пригнічує ферментативну активність комплексу. Зв'язування цАМФ індукує конформаційні зміни в регуляторних субодиницях, внаслідок чого регуляторні субодиниці відокремлюються від каталітичних. Каталітичні ПКА потрапляють у ядро клітини та запускають викладений вище процес.
Мал. 2-16. Регуляція генної транскрипції за допомогою CREB (САМР response element binding protein)через збільшення рівня циклічного аденозинмонофосфату
Життя будь-якої клітини, включаючи глобальні процеси її зростання, поділу і навіть загибелі, залежить від зовнішніх регуляторних сигналів, які вона сприймає. Такими сигналами можуть бути фізичні дії (температура, іонізуюче та інше електромагнітне випромінювання) або численні хімічні сполуки. Добре вивченими речовинами, які організм використовує для регуляції життєдіяльності клітин, є, наприклад, стероїдні гормони, цитокіни або фактори росту, які, досягаючи клітин-мішеней, викликають у них специфічні метаболічні зміни, пов'язані у тому числі зі зміною експресії великих груп генів. Не менш сильну і часто специфічну відповідь викликають різні фізіологічно активні речовини екзогенного походження, наприклад феромони або токсини.
Всі ці сигнали, що передаються через відповідні сигнальні молекули, є первинними по відношенню до тих каскадів біохімічних реакцій, які запускаються у клітинах у відповідь на їхню дію. Первинні сигнали розпізнаються клітинами завдяки наявності у них спеціальних молекул-рецепторів білкової природи, які взаємодіють із первинними сигнальними молекулами чи впливами фізичної природи. Первинний сигнал, як правило, не діє прямо на ті метаболічні процеси у клітині, для регуляції яких він призначений. Натомість рецептор, що його сприймає, ініціює утворення в клітині проміжних хімічних сполук, що запускають внутрішньоклітинні процеси, вплив на які був метою первинного позаклітинного сигналу. Оскільки такі проміжні з'єднання несуть у собі інформацію про первинному регуляторному сигналі і є його вторинними переносниками, вони отримали назву вторинних месенджерів. Ними можуть бути різні іони, циклічні нуклеотиди, продукти деградації ліпідів та низку інших хімічних сполук біогенного походження.
Використання еукаріотів системи вторинних месенджерів переводить їх на новий рівень інтеграції всіх метаболічних та катаболічних процесів, що необхідно для існування багатоклітинних організмів. Зокрема, вторинні месенджери дозволяють багаторазово посилювати первинний регуляторний сигнал від позаклітинних регуляторних молекул, які завдяки цьому здійснюють свою дію, перебуваючи у невеликих концентраціях у позаклітинному просторі. Крім того, багато груп клітин і тканин набувають здатності до однотипної та одночасної реакції на первинний регуляторний сигнал, наприклад на дію гормону будь-якого органу ендокринної системи. Це забезпечує можливість швидкої адаптації багатоклітинного організму до умов внутрішнього і навколишнього середовища, що змінюються.
Трансмембранне перенесення первинних сигналів.Для того щоб первинний регуляторний сигнал досяг ядра і вплинув на експресію генів-мішеней, він повинен пройти через двошарову мембрану саме тих клітин, яким він призначений. Як правило, це досягається завдяки наявності на поверхні клітин рецепторів білкової природи, що специфічно вибирають із навколишнього середовища сигнали, розпізнати які вони в змозі (рис. I.22). У найпростішому випадку, коли як низькомолекулярні регулятори виступають гідрофобні хімічні сполуки, розчинні в ліпідах мембран (наприклад стероїдні гормони), для їх перенесення не використовуються рецептори, і вони проникають в клітину шляхом радіальної дифузії. Усередині клітин такі сполуки специфічно взаємодіють з білковими рецепторами, а комплекс, що утворюється, переноситься в ядро, де надає свій регуляторний вплив на транскрипцію відповідних генів (див. рис. I.22, а).
На відміну від цього рецептори мембран, орієнтовані у позаклітинний простір, мають здатність здійснювати транспорт ліганду-регулятора всередину клітин за допомогою ендоцитозу (поглинання шляхом втягування мембрани) комплексу ліганд-рецептор у складі мембранних везикул. Такий механізм використовується, зокрема, для перенесення клітин молекул холестерину, асоційованих з рецепторами ліпопротеїнів низької щільності (див. рис. I.22, б). Інший тип рецепторів, орієнтованих на позаклітинні ліганди – це трансмембранні молекули або група молекул. Взаємодія з лігандом зовнішньої частини таких молекул супроводжується індукцією ферментативної активності, асоційованої з внутрішньоклітинною частиною того ж поліпептиду (див. рис. I.22, в). Прикладами подібних рецепторів, що мають активність тирозинових протеїнкіназ, є рецептори інсуліну, епідермального фактора росту або фактора росту тромбоцитів. У синапсах нейронів та місцях контакту нейром'язових тканин ліганди-нейромедіатори (наприклад ацетилхолін або -аміномасляна кислота) взаємодіють з трансмембранними іонними каналами (див. рис. I.22, г). У відповідь це відбувається відкриття іонних каналів, що супроводжується переміщенням іонів через мембрану і швидкою зміною трансмембранного електричного потенціалу. Інші трансмембранні рецептори здійснюють зв'язок білків позаклітинного матриксу з мікрофіламентами цитоскелета клітин та регуляцію форми клітин, що залежить від позаклітинного матриксу, їх рухливості та росту (див. рис. I.22, д). Нарешті велика група позаклітинних сигналів розпізнається рецепторами, асоційованими на внутрішній поверхні мембрани з GTP-зв'язуючими білками, які, у свою чергу, у відповідь на первинний сигнал починають синтез вторинних месенджерів, що регулюють активність внутрішньоклітинних білків (див. рис. I.22, е). Класифікація за структурною ознакою рецепторів, що здійснюють перенесення сигналу клітини через мембрани, наведена в табл. I.12.
Мал. I.22. Способи передачі позаклітинних регуляторних сигналів через мембрани еукаріотичних клітин (а – е )
Y та Y–P – нефосфорильовані та фосфорильовані залишки Tyr у білках відповідно. Показано також перетворення попередника X на вторинний месенджер Z
Усі рецептори, що у трансмембранной передачі сигналу, поділяють на три класу. У цьому, зазвичай, враховується подібність чи відмінність вторинних структур субодиниць, а чи не особливості їх амінокислотних послідовностей. Рецептори 1-го класу утворюють олігомерні структури навколо пір у мембранах. Перенесення сигналу у разі відбувається внаслідок відкриття чи (у разі) закриття іонних каналів. Основна частина рецепторів 2-го класу занурена в мембрани, і кожна субодиниця містить послідовності, що розпізнаються G-білками (див. нижче). Для всіх субодиниць цього класу характерна наявність трансмембранної (ТМ) послідовності, яка 7 разів перетинає мембрану. Субодиниці рецепторів 3-го класу мінімально занурені в мембрани, що забезпечує рухливість рецепторів та можливість їх інтерналізації (переходу до цитоплазми клітин у складі мембранної везикули). Більшість поліпептидних ланцюгів цих субодиниць експонована назовні клітин.
Вторинні месенджери.Гіпотеза про те, що дія гормонів на метаболізм клітин та експресію генів опосередковується внутрішньоклітинними вторинними месенджерами, вперше з'явилася після відкриття наприкінці 1950-х років Е. Сазерлендом циклічного аденозин-3',5'-монофосфату (cAMP). До теперішнього часу список вторинних месенджерів розширився і включає циклічний гуанозин-3',5'-монофосфат, фосфоїнозитиди, іони Ca 2+ і H + , метаболіти ретиноєвої та арахідонової кислот, закис азоту (NO), а також деякі інші хімічні сполуки біогенного . Детальний розгляд особливостей механізму дії кожного з них виходить за рамки даної монографії, хоча всі вони можуть специфічно впливати на експресію генів.
Вторинні посередники (вторинні месенджери, англ. second messengers) – це малі сигнальні молекули, компоненти системи передачі сигналу у клітині. Вторинні посередники є компонентами каскадів передачі сигналу, що швидко утворюються і далі активують ефекторні білки, які опосередковують відповідь клітини. До найпоширеніших вторинних посередників належать цАМФ та інші циклічні нуклеотиди, іони кальцію, оксид азоту.
Концентрація вторинних посередників у цитозолі може бути підвищена різними шляхами: активацією ферментів, які їх синтезують, як, наприклад, у разі активації циклаз, що утворюють циклічні форми нуклеотидів (цАМФ, цГМФ), або шляхом відкривання іонних каналів, що дозволяють потоку іонів металів, наприклад, іонів кальцію увійти в клітину. Ці малі молекули можуть далі пов'язувати та активувати ефекторні молекули - протеїнкінази, іонні канали та різноманітні інші білки.
А. Циклічний АМФ
Біосинтез. Нуклеотид цАМФ (3",5"-циклоаденозинмонофосфат, сАМР) синтезується мембранними аденілатциклазами - сімейством ферментів, що каталізують реакцію циклізації АТФ (АТР) з утворенням цАМФ та неорганічного пірофосфату. Розщеплення цАМФ з утворенням АМФ (AMP) каталізується фосфодіестеразами, які інгібуються при високих концентраціях метильованих похідних ксантину, наприклад, кофеїном.
Активність аденілатциклази контролюється G-білками, які у свою чергу пов'язані з рецепторами третього типу, керованими зовнішніми сигналами (див. 372). Більшість G-білків (Gs-білки) активують аденілатциклазу, деякі G-білки її пригнічують (Gi-білки). Деякі аденілатциклази активуються комплексом Са2+/кальмодулін.
Механізм дії. цАМФ є алостеричним ефектором протеїнкіназ А (ПК-Α) та іонних каналів (див. с. 372). У неактивному стані ПК-Α є тетрамером, дві каталітичні субодиниці (К-субодиниці) якого інгібовані регуляторними субодиницями (Р-субодиниці) (аутоінгібування). При зв'язуванні цАМФ Р-субодиниці дисоціюють з комплексу та К-одиниці активуються. Фермент може фосфорилювати певні залишки серину та треоніну у більш ніж 100 різних білках, у тому числі в багатьох ферментах (див. с. 158) та факторах транскрипції. Внаслідок фосфорилювання змінюється функціональна активність цих білків.
Поряд із цАМФ функції вторинного месенджера може виконувати і цГМФ (cGMP) (див. с. 346). Обидві сполуки розрізняються за метаболізмом та механізмом дії.
Б. Роль іонів кальцію
Рівень іонів кальцію. Концентрація іонів Са2+ у цитоплазмі нестимульованої клітини дуже низька (10-100 нМ). Низький рівень підтримується кальцієвими АТФ-азами (кальцієвими насосами) та натрій-кальцієвими обмінниками. Різке підвищення концентрації іонів Са2+ у цитоплазмі (до 500-1000 нМ) відбувається внаслідок відкривання кальцієвих каналів плазматичної мембрани або внутрішньоклітинних кальцієвих депо (гладкого та шорсткого ендоплазматичного ретикулуму). Відкриття каналів може бути викликане деполяризацією мембран або дією сигнальних речовин, нейромедіаторів (глутамат та АТФ, див. с. 342), вторинних месенджерів (ІФ3 та цАМФ), а також речовини рослинного походження ріанодину. У цитоплазмі та клітинних органелах є безліч білків, здатних зв'язувати Са2+, деякі з них виконують роль буфера.
При високій концентрації в цитоплазмі іони Са2+ має на клітину цитотоксичну дію. Тому рівень кальцію в окремій клітині зазнає короткочасних сплесків, збільшуючись у 5-10 разів, а стимуляція клітини збільшує лише частоту цих флуктуацій.
Дія кальцію опосередкована спеціальними Са2+-зв'язуючими білками («кальцієвими сенсорами»), до яких належать анексин, кальмодулін та тропонін (див. с. 326). Кальмодулін – порівняно невеликий білок (17 кДа) – присутній у всіх тваринних клітинах. При зв'язуванні чотирьох іонів Са2+ (на схемі блакитні кружечки) кальмодулін перетворюється на активну форму, здатну взаємодіяти з численними білками. За рахунок активації кальмодуліну іони Са2+ впливають на активність ферментів, іонних насосів та компонентів цитоскелету.
B. Інозит-1,4,5-трифосфат та діацилгліцерин
Гідроліз фосфатидилінозит-4,5-дифосфату [ФІФ2 (PlnsP2)] фосфоліпазою С призводить до утворення двох вторинних месенджерів: інозит-1,4,5-трифосфату та діацилгліцерину. Гідрофільний ІФ3 надходить в ендоплазматичний ретикулум [ЕР(ЕR)] та індукує вивільнення іонів Са2+ із запасних везикул. Ліпофільний ДАГ залишається в мембрані та активує протеїнкіназу C, яка у присутності Са2+ фосфорилює різні білкові субстрати, модулюючи їх функціональну активність.